Определение чувствительности микроорганизмов к энтеросептолу методом разведений в жидких средах

Готовят основной раствор энтеросептола с концентрацией 200 мкг/мл. Для этого 2 мл чистого энтеросептола помещают стерильную пробирку, добавляют 2 мг 0,1-Nраствора едкого натра, несколько раз тщательно взбалтывают и через 1 час добавляют 8 мл стерильной дистиллированной воды, опять взбалтывают и через несколько часов прозрачный раствор готов к употреблению. При хранении в холодильнике стабилен в течение месяца.

Для определения чувствительности одного штамма микроорганизмов берут 4 пробирки, содержащие по 2 мл стерильной питательной среды. В первую пробирку добавляют 0,1 мл, во вторую – 0,2 мл, в третью – 0,4 мл основного раствора энтеросептола. Четвертая пробирка контрольная, энтеросептол к ней не добавляют. Производят заражение 18-часовой культурой.

Через 18-24 часа, а для медленно растущих микробов – через 48-72 часа оценивают результаты. Если во всех трех опытных пробирках отмечается обильный рост бактерий, культура рассматривается как устойчивая к действию энтеросептола. Если обильный рост отмечается только в первых двух пробирках – как слабо чувствительная, при росте только в первой пробирке – как чувствительная. Отсутствие или резкая задержка роста во всех трех опытных пробирках указывает на высокую чувствительность исследуемого штамма микроорганизмов.

Ускоренные методы определения чувствительности микробов к антибиотикам.

При использовании обычных методов определения чувствительности микробов к антибиотикам - метода серийных разведений в жидкой или плотной питательной среде, метода диффузии в агар, “бумажных дисков”- ответ может быть получен не ранее чем через 16-18 часов от начала исследования (без учета времени, необходимого для выделения чистой культуры). Это приводит к тому, что в большинстве случаев, особенно при тяжёлом течении инфекционных процессов, лечение антибиотиками начинают до получения данных лабораторного исследования. Вследствие этого практический интерес представляют ускоренные методы определения чувствительности.

В зависимости от принципов, положенных в основу этих методов, их можно распределить на следующие группы:

1. методы, основанные на изменении ферментативной активности микроорганизмов при воздействии антибиотиков;

2. методы, основанные на изменении цвета редокс-индикаторов при изменении окислительно-восстановительного потенциала среды в процессе роста микробов в присутствии антибиотиков;

3. методы, основанные на цитологической оценке изменений морфологии бактериальных клеток под воздействием антибиотиков.

К первой группе относят метод Роджерса и соавторов (1953), основанный на способности антибиотиков подавлять ферментативную активность чувствительных к ним микробов, что сопровождается изменением цвета соответствующего индикатора. Сущность метода заключается в дифференцированном изменении красного цвета индикатора (феноловый красный) в жёлтый или фиолетовый в зависимости от чувствительности исследуемого штамма микроорганизма к антибиотику. В случае чувствительности к действию антибиотика штамма возбудителя не происходит сбраживание глюкозы при культивировании на среде, содержащей глюкозу, феноловый красный (в качестве индикатора) и определённые концентрации антибиотика. При этом среда окрашивается в фиолетовый цвет вследствие её подщелочивания. Изменение красного цвета среды на жёлтый свидетельствует о расщеплении глюкозы с образованием кислоты в результате роста штамма, устойчивого к действию присутствующего в среде антибиотика. При добавлении к среде культивирования 0,25 % дрожжевого экстракта результаты исследования могут быть учтены через 2,5 часа после его начала.

Использование ускоренных методов, относящихся ко второй группе, основано на изменении окислительно-востановительного потенциала питательной среды в процессе роста микроорганизмов, о чем судят по изменению цвета добавляемых к среде индикаторов (резазурин, 1, 3, 5 – трифенилтетразолхлорид, 2, 6 – дихлорфенолиндофенол и др.) Эти методы отличаются технической простотой, а результаты исследования при их использовании могут быть учтены в течение 2-6 часов.

Расплавленный и охлажденный до 50 ºС питательный агар смешивают с агаровым смывом суточной изучаемой культуры (из расчета 200 млн. микробных тел в 1 мл питательной среды) или 1 мл (или меньше) непосредственно исследуемого материала (гной, раневое отделяемое и др.).

Выливают в чашку Петри в количестве 15 мл. На застывшей поверхности размещают диски, пропитанные антибиотиками. Чашки инкубируют при 37 ºС в течение 3-5 часов, затем обрабатывают индикатором (3-5 мл на каждую чашку) и повторно инкубируют в течение 20-30 минут при t 37 ºC. Учет результатов производят по изменению цвета среды вокруг дисков с антибиотиками. При использовании в качестве индикатора 1% раствора 1,3,5-трифенилтетразолхлорида участки агара с бактериальным раствором вследствие образования формазана окрашиваются в красный цвет, а зоны подавления роста микробов вокруг дисков с антибиотиками остаются бесцветными.

При использовании в качестве индикатора 2,6-дихлорфенолиндофенола для исследования применяют двухслойный агар.

В чашку Петри наливают 15 мл питательного агара. После застывания первого слоя, на него наносят второй слой. Для этого пробирки с 10 мл расплавленного и охлажденного до 50 ºС агара заражают взвесью испытуемых микробов из расчета 200 млн. микробных тел на 1 мл. На застывшую поверхность второго слоя агара накладывают индикаторные диски с антибиотиками. Через 3-4 часа инкубации при t37 ºCповерхность чашек заливают 0,2 % раствором 2,6-дихлорфенолиндофенола на дистиллированной воде. Через несколько минут в местах роста микробов происходит восстановление и обесцвечивание растворов индикатора; зоны подавления роста вокруг дисков с антибиотиками остаются окрашенными в синий цвет.

Зоны подавления роста измеряются и оцениваются как в методе диффузии в агар с применением дисков.

Наряду с химическими индикаторами используются и биологические, в частности гемоглобин крови.

Питательную среду в стерильные чашки Петри, установленные горизонтально, заливают в два слоя: нижний слой – 15-20 мл среды с добавление 10% цитратной донорской крови, среда должна быть ярко красного цвета; верхний слой – среда без добавления крови, к которой после расплавления и охлаждения до 45-50°С добавляют 1 мл испытуемой культуры микроорганизмов (из расчета 200 млн. т./мл) или 1 мл (или меньше) непосредственно исследуемого материала (гной, раневое отделяемое и др.), тщательно перемешивают и выливают в чашку Петри на поверхность питательного агара с кровью.

На застывшую поверхность второго слоя накладывают диски с антибиотиками как это описано в методе диффузии в агар с применением дисков и чашки помещают в термостат при 37 °С на 5-6 часов.

Участки питательного агара с бактериальным ростом становятся из ярко-красных коричневато-бурыми, т.к. в процессе жизнедеятельности большинство штаммов микроорганизмов создает в питательной среде условия, способствующие переводу гемоглобина в метгемоглобин. Зоны подавления роста вокруг дисков с антибиотиками остаются окрашенными в ярко-красный цвет.

Указанные методы дают возможность судить о степени чувствительности микробов к антибиотикам с той же точностью, что и стандартный метод дисков, однако время исследования сокращается с16-18 до 3-5 часов.

К ускоренным методам определения чувствительности относится метод, с помощью которого обнаруживается образование инволюционных форм бактерий под действием антибиотика при фазово-контрастной микроскопии. Инволюционные формы микроорганизмов образуются в присутствии бактериостатических концентраций антибиотика. В отсутствие его при действии суббактериостатических концентраций, а также при устойчивости изучаемого штамма к препарату вырастают нормальные микроколонии. Морфологические изменения исследуемых культур под действием антибиотика учитывают в специальных микрокамерах. Техника приготовления микрокамер состоит в следующем: в пробирки с 0,5-1 мл расплавленного МПА добавляют равные объемы того или иного антибиотика в двукратно убывающих концентрациях. Содержимое пробирок тщательно перемешивают и выливают на поверхность предметных стёкол. Полученный таким образом ряд стёкол с агаром, содержащим различные концентрации антибиотиков, соответствует ряду чашек Петри или ряду пробирок с убивающими концентрациями антибиотика при методе серийных разведений. Агар заражают (с помощью тонко оттянутой пастеровской пипетки) взвесью исследуемой культуры и накрывают покровным стеклом. Камеры без парафинизации помещают в термостат при t 37 ºC на 3-5 часов. Результаты учитывают по образованию инволюционных форм микробов (при фазово-контрастном микроскопировании) с установлением концентрации антибиотика, вызвавшей их образование (МПК).

Метод фазово-контрастной микроскопии может быть применен для определения чувствительности к антибиотикам штаммов кишечной палочки, стафилококков, холерных вибрионов.

Таким образом, определение чувствительности возбудителей инфекционного процесса к антибактериальным химиопрепаратам является основным лабораторным методом, на основе которого осуществляется выбор оптимального препарата для лечения.