Темнопольная микроскопия

Движение бактерий и спирохет можно наблюдать в темнопольном, который отличается от обычного светового спосо­бом освещения препарата. В этом случае применяют боковое освещение, в силу чего получается изображение светяще­гося объекта на темном фоне. Принцип темного поля основан на том, что падающие сбоку световые лучи отклоняются плотными частицами (в частности, микробами) и последние благодаря этому представляются глазу наблюдателя ярко светящимися. Бо­ковое освещение в микроскопе можно получить, заменив, обычный осветитель специальным конденсором с затемнением в центре. Такой конденсор задерживает все центральные лучи света и пропускает лишь периферические (рис.3). Вместо специального конден­сора для темного поля можно пользоваться обычным осветите­лем, между двумя линзами которой вставляют кружок черной бу­маги несколько меньшего диаметра, чем линза. Работать надо с сильным источником света (дуговой лампой или обычной лампоч­кой в 200-300 свечей). Техника исследований заключается в следующем. На предметное стекло наносят каплю материала и осторожно накрывают покровным стеклом, чтобы не было пузырь­ков газа. Затем на поверхность конденсора помещают каплю воды или кедрового масла, и предметное стекло с препаратом кладут на эту каплю.

Препарат рассматривают либо через сильную сухую систему (объектив 40), либо через иммерсионную систему. В последнем случае на покровное стекло также наносят каплю кедрового масла, а к иммерсии привинчивают маленькую муфточку – диа­фрагму, чтобы сузить диаметр просвета объектива.

При микроскопии этим методом лучи, освещающие объект, не попадают в объектив микроскопа, поле зрения остается темным, а объект на его фоне кажется светящимся (рис. 4). Эффект темного поля создается при помощи специального конденсора (параболоид или кардиоид) или обычного конденсора с прикрытой кружком черной бумаги центральной частью.

Для наблюдения в темном поле свет устанавливают и цен­трируют, как для светлого поля, и, заменив конденсор специ­альным, прибавляют свет до максимума, раскрыв до отказа диа­фрагму и включив реостат осветителя.

Препараты для исследования в темном поле должны быть приготовлены на очень чистых предметных и покровных стеклах определенной толщины: предметные – не более 1,2 мм, покров­ные – 0,17 мм. Готовят препарат по типу "раздавленной" или "висячей" капли (рис. 5). Между препаратом и конденсором помещают иммерсионное масло (каплю его наносят на верхнюю линзу конденсора). После этого, поднимая и опуская конденсор, добиваются появления в поле зрения светлого пятна, которое с помощью специальных регули­ровочных винтов конденсора выводят в середину поля зрения. Затем с помощью нужного увеличения переходят к наблюдению.

Фазово-контрастная и аноптральная микроскопия

Фазово-контрастный микроскоп значительно повышает контра­стность объектов, проницаемых для света, и в медицине ис­пользуется для изучения нативных препаратов. С помощью этого метода могут быть исследованы без предварительной обработки бесцветные, прозрачные объекты, детали, строение которых оп­тически мало различаются между собой.

Окрашенные препараты частично поглощают свет. Пучок света, проходящий через такой препарат, теряет в своей ин­тенсивности, т.е. уменьшается амплитуда световой волны, и это легко улавливается глазом исследователя. Такие препараты контрастны даже в обычном микроскопе и называются “амплитуд­ными”. Препараты, не поглощающие света, прозрачны. Пучок света, проходящий через такой препарат, не теряет своей ин­тенсивности. Амплитуда световой волны не изменяется, а лишь изменяется фаза колебания, что не регистрируется человече­ским глазом. Такие объекты называются фазовыми. К ним отно­сятся живые, неокрашенные препараты. Чтобы повысить контра­стность изображения, необходимо превратить фазовые изменения в амплитудные. Это достигается путем помещения в объективы фазовой пластинки в форме кольца и применением кольцевой диафрагмы. Каждому объективу соответствует своя диафрагма. Изображение этой диафрагмы совпадает с кольцом фазовой пла­стинки соответствующего объектива. Метод фазовых контрастов может быть положительным и отрицательным. В первом случае на светлом фоне поля наблюдается темное изображение объекта, а во втором фон темный, а объект светлый. Наилучшие результаты наблюдаются в случае положительного контраста.

Распространение световых волн в прозрачных однородных объектах не сопровождается потерей интенсивности света. Ме­няется только скорость прохождения светового потока через объект по сравнению со скоростью распространения света в окружающей среде. Она будет большей или меньшей в зависимости от того, будет ли показатель светопреломления объекта соответственно меньше или больше, чем в окружающей среде. Эти изменения, называе­мые иначе фазовыми, так как при них меняются только фаза ко­лебаний прошедшего света, характерны для большинства биоло­гических объектов (живых клеток, срезов тканей и т. п.).

Человеческий глаз хорошо определяет изменения интенсив­ности света, наступающие при прохождении через окрашенные (амплитудные) препараты, когда меняется амплитуда колебаний света. Однако глаз не способен воспринимать фазовые измене­ния света. Поэтому прозрачные неконтрастные (фазовые) объ­екты при обычном микроскопическом исследовании остаются не­видимыми.

Для работы по методу фазового контраста нужно, кроме обычного биологического микроскопа, иметь еще специальное устройство. Установку устройства производят следующим обра­зом. Конденсор и объектив заменяют фазовыми. Фазовый конден­сор поворотом револьверного диска устанавливают на 0. Это положение соответствует обычному светопольному конденсору. Затем, поместив на предметный столик препарат и сфокусировав его, приступают к наладке освещения. При исследовании мето­дом фазового контраста основным условием является оптималь­ная освещенность, которая достигается установкой света по Келеру. После этого устанавливают револьверный диск на то число, которое соответствует выбранному объективу; например, при объективе 40 в окошечке также устанавливают цифру 40. Вынув окуляр, на его место устанавливают вспомогательный микроскоп и настраивают его на изображение двух колец (коль­цевая диафрагма конденсора и фазовая пластинка). Центро­вочным устройством конденсора добиваются совмещения колец. Заменив вспомогательный микроскоп окуляром, можно произво­дить исследование препарата.

Метод аноптрального контраста является усовершенствованием метода фазового контраста. Теоретические обоснования и конструктивные особенности аноптрального устройства, в основном не отличаются от обычной фазово-контрастной установки (рис. 6). Принцип его устройства заключается в следующем. На верхнюю поверхность предпоследней линзы иммерсионного объектива наносится кольцо из сажи, пропускающей лишь около 10% проходящего света. В передней фокальной плоскости кон­денсора помещается кольцевая диафрагма, изображение которой должно полностью совпадать с кольцом сажи на объективе. Пре­парат освещается полным конусом лучей, проходящих через кольцевую диафрагму конденсора. При отсутствии объектов (например, микробов в препарате) в объектив попадают только недифрагированные лучи, амплитуда которых, после того как они пройдут через кольцо сажи, уменьшится на 90%. В то же время амплитуда лучей, дифрагированных частицами объекта, которые пройдут мимо кольца из сажи, не изменится и поэтому фон поля будет темный, а частицы объекта светлыми. Пре­имуществом метода аноптральной микроскопии является боль­шая разрешающая способность объективов и возможность выяв­ления минимальных оптических разностей плотности в неокра­шенных препаратах. Чем больше оптическая плотность объекта, тем светлее его изображение. Методика использования устрой­ства не отличается от фазово-контрастного. При помощи аноптрального микроскопа можно изучать морфо­логию и локализацию нуклеоидов (ядерный аппарат), наблюдать за изменениями морфологии бактерий в процессе нормального роста и размножения.