1.2. Електрофорез. Використання в молекулярній біології
Електрофорез (від електро- та грец. Φορέω - «переношу») - це електрокінетичнt явище переміщення частинок дисперсної фази (колоїдних або білкових розчинів) в рідкому або газоподібному середовищі під дією зовнішнього електричного поля. Вперше було відкрито професорами Московського університету П. І. Страховим і Ф. Ф. Рейссом в 1809 році.
Електрофорез застосовують у фізіотерапії, в хімічній промисловості, для осадження димів і туманів, для вивчення складу розчинів та ін. Електрофорез є одним з найбільш важливих методів для розділення і аналізу компонентів речовин в хімії, біохімії та молекулярної біології.
У біохімії та молекулярної біології електрофорез використовується для розділення макромолекул - білків і нуклеїнових кислот (а також їх фрагментів). Розрізняють безліч різновидів цього методу. Цей метод знаходить найширше застосування для розділення сумішей біомолекул на фракції або індивідуальні речовини і використовується в біохімії, молекулярній біології, клінічній діагностиці, популяційної біології (для вивчення генетичної мінливості) і ін.
Електрофорез білків - спосіб розділення суміші білків на фракції або індивідуальні білки, заснований на русі заряджених білкових макромолекул різного молекулярного ваги в стаціонарному електричному полі. Електрофорез білків застосовують як для аналізу компонентів суміші білків, так і для отримання гомогенного білка.
Варіанти методу електрофорезу білків
Існує безліч різновидів і модифікацій даного методу, які використовуються (або використовувалися в певні періоди розвитку біохімії та молекулярної біології) в різних областях:
Електрофорез у вільних середовищах (без підтримуючої середовища)
Електрофорез з рухомою границею
Зональний електрофорез без підтримуючого середовища
Зональний електрофорез в підтримуючої середовищі з капілярною структурою
Електрофроез білків в крохмальної гелі
Електрофорез білків в поліакриламідному гелі (ПААГ) Електрофорез білків в агарозному гелі
Електрофорез на фільтрувальному папері
Електрофорез білків на ацетат-целюлозної мембрані
Електрофорез в колонках і блоках гранульованої підтримуючого середовища
Капілярний електрофорез
Електрофорез білків підрозділяється також на одномірний і двовимірний (2D) електрофорез, препаративний і аналітичний, а також електрофорез нативних білків і електрофорез у присутності детергенту (в денатуруючих умовах). Різновидом методу електрофорезу є ізоелектричного фокусування і ізотахофорез. У разі використання імунологічних методів для виявлення розділених білків говорять про іммуноелектрофорез.
Залежно від конструкції електрофоретичного апарату розрізняють горизонтальний і вертикальний електрофорез білків.
Електрофорез білків на папері
Принцип фракціонування (електрофорезу) заснований на тому, що в електростатичному полі білки рухаються по змоченою буферним розчином хроматографічному папері (ацетатцеллюлозной плівці, крахмаловому, агаровому гелям) зі швидкістю, що залежить в основному від величини електричного заряду та молекулярної маси частинок. Внаслідок цього білки поділяються на фракції. При обробці барвниками білки зв'язуються з ними пропорційно своєї концентрації. Визначивши інтенсивність фарбування, можна обчислити концентрацію білкових фракцій.
Система для електрофорезу. Блок живлення повинен давати стабілізований струм силою 2-100 мА при напрузі 180— 300 В.
Електрофоретична камера. Для запобігання смуги носія від висихання в камері повинна підтримуватися певна вологість повітря. При нагріванні паперу посилено випаровується буферний розчин у середині смуги і з країв стрічки, що обумовлює його рух (реофорез) і внаслідок цього зміна форми плям фракцій білків у процесі їх электрофоретического поділу; тому окремі конструкції электрофоретических камер розташовують системою охолодження смужок носія.
У різних відділах камери буферний розчин повинен мати однаковий рівень, щоб уникнути його переливу через стрічку в результаті сифонового дії. Кінці смужок носія не слід занурювати в буферний розчин, в якому знаходяться електроди. Електричну зв'язок між стрічками і електродами встановлюють за допомогою містків з паперових смужок (вати, марлі), змочених буферним розчином; цим усувається передача змін рН буфера в той простір, в яке занурені стрічки.
Оскільки смуга ацетатцеллюлозной плівки (паперу) може бути розташована як горизонтально, так і під кутом до горизонталі (вертикально), відповідно розрізняють горизонтальний і вертикальний електрофорез. Перший з них дозволяє отримати більш точні результати. Важливо, щоб смужка носія (хроматографічного паперу, ацетатцеллюлозной плівки) була добре натягнута. Бажано, щоб вона розташовувалася як би в «підвішеному» стані, підтримувана вертикально розташованої перегородкою, системою натягнутих капронових ниток, а зв'язує обидві ванни місток мав шипи для укладання на них смужок. Це запобігає утворення тонкого капілярного шару буферного розчину між смужкою ацетатцеллюлозной плівки, хроматографічного паперу і пластиною; капілярний шар буферного розчину в значній мірі погіршує якість электрофоретичного поділу.
Велике значення мають властивості носія, використовуваного для електрофорезу. Ацетатцелюлозних плівка, як і хроматографічний папір, повинна бути однорідною і щільною. Оскільки в окремих лабораторіях все ще використовують хроматографічну папір, щодо її як носія необхідно зазначити наступне.
Обраний сорт паперу: «хроматографічний швидка» або «хроматографічний повільна» — не можна міняти, так як від цього в певній мірі залежать одержувані результати. Якщо хроматографічний папір підлягає денситометрії, то рекомендується швидко поглинається сорт, в інших випадках краще користуватися папером для повільного всмоктування (марки «М»). Папір марки «М» має гладку лицьову і рубчасту зворотну сторони. При уважному розгляді зворотного боку можна помітити грубі і великі штрихи, що йдуть паралельно довшій стороні аркуша. Ці штрихи відображають хід волокон целюлози. Застосовуються для електрофорезу паперові смужки розміром 3,5 х 40 см (або іншого формату, відповідного габаритами електрофоретичної камери), нарізають таким чином, щоб волокна целюлози йшли вздовж смужок. Завдяки цьому кожна смужка паперу являє собою систему поздовжньо йдуть капілярів, що сприяє просуванню білків та інших речовин) і перешкоджає розтіканню до краях смужки. Крім того, отримана стрічка, на відміну від аналогічної з поперечним ходом волокон целюлози, менше деформується при зволоженні і висиханні.
Напрямок ходу волокон целюлози в папері можна визначити і за розтіканню на неї краплі води, що приймає форму еліпса, довгошерстий якого відповідає поширенню волокон целюлози.
Підготовка до електрофорезу та процедура його проведення. Перед електрофорезом камеру встановлюють строго горизонтально. Кювети заповнюють буферним розчином таким чином, щоб рівень рідини в них був однаковий. Обидва відділення кожній кювети з'єднують один з одним смужкою фільтрувального паперу. Смужки ацетатцеллюлозной плівки (хроматографічного паперу) рівномірно натягують між кюветными відділеннями. Необхідно, щоб кінці зволожених буфером смуг (мембран) були занурені в буферний розчин внутрішніх відділень (якщо такі є) електродних кювет.
Найкращі результати дає метод просочування хроматографічного паперу буферним розчином. Однак на практиці в цілях економії часу стрічки зазвичай змочують у буфері і злегка висушують, віджимаючи між листами фільтрувального паперу.
Нанесення на смужку носія біологічного матеріалу здійснюється за допомогою аплікатора (спеціального або імпровізованого) або мікропіпетки (автоматичною, звичайною). Буферні розчини. На електрофоретичне фракціонування білків великий вплив має рН буферних розчинів, склад і концентрація складових їх реагентів, так як від кислотності (лужності) середовища, іонної сили буферної суміші й деяких інших факторів багато в чому залежать знак і величина електричного заряду молекул білків.
В якості електроліту найчастіше застосовують веронал-мединаловый, веронал-ацетатний, мединаловый, трис-буфер. Рідше використовують боратный і фосфатний буфер.
Найбільш добре зарекомендували себе такі буферні розчини:
Вероналовый (веронал-мединаловый) буфер з рН 8,6.
Веронал-ацетатний буфер з рН 8,6.
Мединаловый буфер з рН 7,6.
Трис-буферу з рН 8,9 (дуже добре розділяються білки сироватки крові (з виділенням до 9 фракцій) при використанні трис-буферу з рН 8,9).
Калій-фосфатний буфер рН8.0 -8.3
Для фарбування электрофореграм сухі паперові стрічки або зволожені буферним розчином плівки кладуть в розгорнутому вигляді на дно плоских емальованих кювет і обережно, повільно доливають або розбризкування розчину барвника. В процесі обробки реагентами электрофореграммы не можна накладати один на одного і згортати.
Фарбувальні реагенти. Основним їхнім компонентом є індикатори (бромфеноловый синій, кислотний синьо-чорний, амидо чорний 10 та деякі інші), що представляють собою барвники, які характерно зв'язуються з білком. Нінгідрин - органічна сполука, що відносяться до класів кетонів, спиртів і конденсованих карбоціклов. Призматичні кристали білого або жовтого кольору, при нагріванні розчиняється у воді. Нінгідрин використовується як якісний і кількісний реактив при визначенні первинних амінів і амінокислот. 2% розчин Нінгідрин в етиловому спирті або ацетоні використовується в криміналістиці для виявлення слідів папілярного узору на пористих поверхнях, наприклад на папері. Амінокислоти відкривають кольоровою реакцією з нингидрином. У присутності амінокислот або амінів виникає синє, фіолетове або червоне пляма або кільце. Реакцію дають всі амінокислоти (крім проліну і оксипролін).
Під час досліду ми використовували електрофорез на папері, методика якого буде описана нижче.
РОЗДІЛ II. МАТЕРІАЛИ, МЕТОДИ ТА ОБЛАДНАННЯ