Научные стремления 2012-1

добавлении праймеров в концентрации 1,0 мкМ и использовании следующих температур отжига: 32 ºС для праймера Bif-1, 46 °С – для Р1, 35 °С – для Р2.

При проведении RAPD-ПЦР с праймером Bif-1 для исследуемых штаммов бифидобактерий были получены фингерпринты, содержащие 2– 5 полос размером 400–3000 п.н., однако, идентификация многих из них была затруднена из-за присутствия неспецифических продуктов амплификации.

При использовании праймера Р2 четко различимые RAPD-фрагменты размером 700–2100 п.н. присутствовали в фингерпринтах штаммов B. animalis ssp. animalis, B. pseudolongum, B. boum. Для штаммов, относящихся к видам

праймером Р1, при амплификации с которым образовывалось 4–10 полос размером 200–6000 п.н (рисунок). RAPD-фингерпринты культур B. adolescentis были представлены 5–7 фрагментами размером 400–2800 п.н.;

B. angulatum – 5–6 фрагментами размером 500–1800 п.н.; B. animalis ssp. lactis

– 4–7 фрагментами размером 200–2200 п.н.; B. animalis ssp. animalis – 5–7 фрагментами размером 400–6000 п.н.; B. bifidum – 7–10 фрагментами размером 300–5000 п.н.; B. boum – 4 фрагментами размером 400–1500 п.н.;

B. longum – 4–8 фрагментами размером 200–2800 п.н.; B. pseudolongum – 4–5

присутствовали как общие для вида полосы (например, 1600 и 850 п.н. у штаммов B. animalis; 700 п.н. у B. longum), так и индивидуальные штаммоспецифичные полосы (например, 2400 и 1700 п.н у B. adolescentis ВКПМ Ас-1662; 2600, 1800, 1600 п.н. у B. adolescentis Н1), отражающие их генетические отличия на уровне штаммов, что позволило провести их штаммовую дифференциацию.

281

а) 1 – B. animalis ssp. lactis ВКПМ Ас-1693, 2 – B. animalis ssp. lactis БИМ В-522,

3 – B. animalis ssp. lactis БИМ В-523, 4 – B. animalis Н2, 5 – B. animalis А6, 6 – B. animalis И1, 7 – B. adolescentis ВКПМ Ас-1662, 8 – B. adolescentis Н1;

б) 1 – B. animalis ssp. animalis ВКПМ Ас-1663, 2 – B. animalis ssp. animalis ВКПМ Ас-1747, 3 – B. animalis К3, 4 – B. animalis Д1, 5 – B. animalis КО3, 6 – B. animalis КО4, 7 – B. boum Д3, 8 – B. boum Д4, 9 – B. boum 6, в) 1 – B. longum ssp. infantis ВКПМ Ас-1665,

2 – B. longum ssp. longum ВКПМ Ас-1732, 3 – B. longum В379М, 4 – B. longum БИМ В-521, 5 – B. longum H3, 6 – B. longum В3, 7 – B. longum А4, 8 – B. angulatum ВКПМ Ас-1714,

9 – B. angulatum БИМ В-524, г) 1 – B. pseudolongum ssp. globosum ВКПМ Ас-1752, 2 – B. pseudolongum С6, 3 – B. pseudolongum К4, 4 – B. thermophilum ВКПМ Ас-1746, 5 – B. thermophilum 4, 6 – B. bifidum Ас-1662, 7 – B. bifidum 791, 8 – B. bifidum ЛВА-3, 9 – B. bifidum БИМ В-525, М – маркер молекулярной массы ДНК

Рисунок – Электрофореграмма RAPD-фингерпринтов бифидобактерий

Данные о генетических особенностях коллекционных и выделенных из природных источников штаммов бифидобактерий, полученные с помощью ERIC-ПЦР и RAPD-ПЦР, были использованы для их генетической паспортизации.

Выводы. Полученные данные свидетельствуют, что ERIC-ПЦР является предпочтительным методом для дифференциации бифидобактерий на уровне вида и подвида, а RAPD-ПЦР с праймером P1 – для их идентификации на уровне штамма. Результаты молекулярного типирования бифидобактерий с помощью методов ERIC-ПЦР и RAPD-ПЦР позволили провести их внутривидовую дифференциацию, выявить генетические отличия на уровне штаммов, осуществить их генетическую паспортизацию.

Литературные источники

1.Euzeby, J.P. List of procariotic names with standing in nomenclature − genus

Bifidobacterium // J.P. Uzeby SBSV [Electronic resource]. – 2012. – Mode of access: http://www.bacterio.cict.fr. – Date of access: 01.10.2012.

2.Getting better with bifidobacteria / S.C. Leahy [et al.] // J. Appl. Microbiol. – 2005. – Vol. 98. – P. 1303–1315.

3.Шендеров, Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание: в 3 т. / Б.А. Шендеров. – М.: Грантъ, 2001. – Т. 3: Пробиотики и функциональное питание. –

288с.

4.Identification and tracing of Bifidobacterium species by use of enterobacterial repetitive

intergenic consensus sequences / M. Ventura [et al.] // Appl. Environ. Microbiol. – 2003. – Vol. 69. – P. 4296–4301.

5.Microbiological evaluation and molecular characterization of bifidobacteria strains in

commercial fermented milks / M.C. Collado [et al.] // Europ. Food Res. Technol. – 2006. – Vol. 222, № 1–2. – P. 112–117.

6. Characterization of sourdough lactic acid bacteria based on genotypic and cell-wall protein analyses / A. Corsetti [et al.] // J. Appl. Microbiol. – 2003. – Vol. 94. – P. 641–654.

Sidarenka A.V., Novik G.I.

INTRASPECIES DIFFERENTIATION OF BIFIDOBACTERIA

USING MOLECULAR TYPING

Institute of Microbiology, National Academy of Sciences, Minsk

Summary

Molecular typing of collection strains and natural isolates of bifidobacteria using ERICPCR and RAPD-PCR techniques was carried out. It was demonstrated that ERIC-PCR is preferable method for bifidobacteria differentiation at species and subspecies level, whereas RAPD-PCR using P1 primer is a reliable method for their identification at strain level. Genetic diversity of bifidobacteria was evaluated and their genetic passportization was performed.

282

УДК 579.61:616–078

Старовойтова Т.А.1, Киселева Е.П.2, Сидоренко А.В.1, Новик Г.И.1

ОСНОВНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОЛИКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ КРОЛИКОВ К АНТИГЕНАМ ЦЕЛЫХ КЛЕТОК

BIFIDOBACTERIUM BIFIDUM 791

1Институт микробиологии НАН Беларуси, Минск

2Институт биоорганической химии НАН Беларуси, Минск

Введение. Бифидобактерии представляют собой неотъемлемую часть симбионтной микрофлоры желудочно-кишечного тракта человека и оказывают существенное влияние на его физиологический, биохимический и иммунный статус. Бифидобактерии широко применяются в качестве пробиотических микроорганизмов в составе продуктов питания и биологически активных добавок (Бифидумбактерин, Линекс, Бифиформ, Пробифор, Флорин форте и др.).

Ранее с использованием в качестве антигена целых клеток пробиотического штамма бифидобактерий Bifidobacterium bifidum 791 нами были получены поликлональные антитела (ПАТ) кролика [1]. Была обоснована возможность использования данных ПАТ в качестве компонентов двух тест-систем, одна из которых предназначена для количественного определения клеток B. bifidum 791 в культуральных средах и других жидкостях методом прямого иммуноферментного анализа (ИФА), а вторая может быть использована для количественного определения антител к антигенам данного штамма бифидобактерий в сыворотке крови человека методом конкурентного ИФА [2]. Исследование перекрестной реакции данных ПАТ с антигенами других видов и штаммов бактерий рода Bifidobacterium позволит (1) расширить область применения двух тест-систем и (2) использовать данные ПАТ в исследованиях, направленных на уточнение классификации бактерий рода Bifidobacterium и выбор наиболее биотехнологически перспективных штаммов бифидобактерий.

Цели работы – (1) уточнить титр ПАТ кролика, выработанных к целым клеткам B. bifidum 791, (2) определить перекрѐстную реакцию ПАТ с антигенами других видов и штаммов бактерий рода Bifidobacterium.

Материалы и методы исследования. В качестве источника ПАТ использовали антисыворотку (АС) кролика, иммунизированного целыми клетками B. bifidum 791 [2]. Культивирование штаммов В. bifidum 791,

B. longum B379M, B. adolescentis 94 BIM, B. bifidum BIM B-465-D и получение бесклеточных фракций (БФ) указанных штаммов проводили, как указано в работе [1,2].

Определение рабочего титра ПАТ кролика осуществляли методом прямого твердофазного ИФА. С этой целью БФ B. bifidum 791 разводили 0,01 М натрий-фосфатным буфером (НФБ), рН 7,0, до значений оптической плотности при длине волны 258 нм (D258) равных 0,05 о.е. и 0,01 о.е. Каждый раствор вносили в соответствующую серию лунок полистирольных

283

планшетов Greiner bio-one (Germany) из расчета 100 мкл на лунку и иммобилизовали в течение ночи при 4 оС. Промывали лунки. В соответствующие лунки каждой серии вносили по 100 мкл АС, предварительно разведенной в определенное число раз в диапазоне 1/20000 – 1/2560000, и инкубировали 1 ч при 37 оС. Промывали лунки. Вносили в каждую лунку по 100 мкл раствора конъюгата антител овцы против Ig кролика, меченых пероксидазой из корней хрена (ПХ) (Хема, РФ), и инкубировали 1 ч при 37 оС. Промывали лунки. Инициировали и останавливали ферментативную реакцию ПХ как указано в работах [1,2]. Измеряли оптическую плотность растворов в лунках при длине волны 450 нм (D450) с использованием многоканального спектрофотометра (Униплан, РФ).

Определение перекрестной реакции ПАТ кролика проводили методом конкурентного ИФА. Иммобилизовали БФ B. bifidum 791 из раствора с D258, равным 0,025 е.о.п., в 4 сериях лунок. Готовили 4 серии растворов (в соответствии с 4 штаммами бактерий) для прединкубации в пробирках и последующего внесения в лунки на 1 стадии ИФА, по 6 проб в каждой серии (пробы В1 – В6). Кроме того, готовили одну пробу B0. Каждая проба В1 – В6 содержала АС (титр в окончательном объеме каждой пробы равен 1/80000) и БФ соответствующего штамма (значения D258 в окончательном объѐме проб В1 – В6 равны 0,8; 0,4; 0,2; 0,1; 0,05 и 0,025.е.о.п., соответственно). Проба В0

содержала АС в том же титре и буферный раствор вместо БФ. Пробы инкубировали при 37 оС в течение 1 часа. В соответствующие лунки вносили по 100 мкл растворов серий 1 – 4 и инкубировали 1 ч при 37 оС. Проводили 2- ую стадию ИФА и завершали анализ как указано выше.

Результаты исследования и их обсуждение.

Титр ПАТ определяли ИФА, используя планшеты с иммобилизованной БФ B. bifidum 791 и АС кролика, предварительно разведенную в определенное число раз в диапазоне 1/20000 – 1/2560000.

Выявляли иммунные комплексы с использованием антител овцы против Ig кролика, меченых ферментом Рабочим титром считали разведение ПАТ, обеспечивающее в ИФА значение D450, соответствующее максимальному наклону графика (рисунок 1). Анализируя полученную графическую зависимость, можно сделать вывод, что рабочий титр ПАТ находится в диапазоне 1/80000 – 1/640000, соответствующем диапазону концентраций АС в пробе, равному (1,56×104)% – (12,5×104) %. ИФА заключалось в следующем. Использовали четыре серии планшетов, в лунках которых был иммобилизован антиген, специфичный к тестируемым ПАТ. На первой стадии ИФА в контрольных лунках содержался раствор ПАТ к иммобилизованному антигену (Во). В лунках планшетов первой серии находился раствор, содержащий одновременно ПАТ к иммобилизованному антигену и антиген, идентичный иммобилизованному на твердой фазе, в виде ряда концентраций (В1 – Вn). В лунках планшетов второй – четвертой серий в растворе находились другие антигены (по одному антигену для каждой серии), потенциально способные к перекрестной реакции с тестируемыми ПАТ, в

284

виде ряда концентраций (В1 – Вn). По результатам ИФА, представленным графике (рисунок 2), рассчитывали показатель перекрестной реакции антител. Он равен процентному соотношению концентраций специфического и перекрестно-реагирующего антигенов, соответствующих значениям Вn/Во, равным 50 %.

1

60

1,5

40

1

20

0 0,2 0,4 0,6 0,8

Полученные результаты (таблица) свидетельствуют, что ПАТ кролика, иммунизированного целыми клетками B. bifidum 791, в равной степени связываются с антигенами указанного штамма и двух других штаммов – B. longum B379M и B. adolescentis 94 BIM (т.е. являются специфичными к антигенам, характерным для бактерий рода Bifidobacterium), однако практически не взаимодействуют с антигенами B. bifidum BIM B-465-D. Штамм B. bifidum BIM B-465-D отличается от штаммов 791, B379M, 94 BIM наличием у него свойства кислотоустойчивости. Данный штамм содержит уникальные полисахариды, не обнаруженные в составе клеточной стенки других видов и штаммов бифидобактерий, которые, возможно, и являются причиной его кислотоустойчивости [3].

Таблица – Перекрѐстная реакция ПАТ кролика, иммунизированного целыми клетками Bifidobacterium bifidum 791, с антигенами других видов и штаммов бифидобактерий

Перекрѐстная реакция, %

285

УДК 579.67; 57.089

Фальковская У.В.1,2, Сидоренко А.В.2, Новик Г.И.2

ХРАНЕНИЕ БАКТЕРИЙ РОДА BACILLUS МЕТОДОМ ЛИОФИЛИЗАЦИИ

1 Международный государственный экологический университет имени А. Д. Сахарова, Минск

2Институт микробиологии НАН Беларуси, Минск

Бактерии рода Bacillus широко распространены в природе и играют большую роль в разнообразных биологических процессах (круговорот азота, углерода; входят в состав микрофлоры почвы, воды, воздуха). В промышленности бациллы используются для производства ферментов, антибиотиков, органических кислот и других соединений. Среди этой группы бактерий имеются патогенные для человека и животных формы, а также возбудители болезней насекомых. Некоторые виды бацилл являются фитопатогенами и могут вызывать развитие гнили и других поражений у растений [1, 2, 3].

В связи с широким применением бактерий рода Bacillus в биотехнологии актуальной является проблема их длительного сохранения. Для этих целей используют методы лиофилизации и низкотемпературной консервации (хранение при температурах от -20 до -85 °С) [4].

Преимуществом метода лиофилизации является то, что его применение позволяет сохранить без заметных изменений жизнеспособность, морфологические, культуральные, физиологические свойства микроорганизмов, а также их биохимическую активность в течение 10–20 и более лет. Также данный метод удобен для практических целей, так как дает возможность иметь большое число ампул каждой культуры.

Для сохранения жизнеспособности бацилл в период лиофилизации и последующего хранения большое значение имеют состав защитной среды, остаточная влажность препаратов, температура хранения. Различные вещества, включая углеводы, протеины молока, пептон, желатин, мясной экстракт, глицерин и фосфаты, используют для защиты клеток от повреждений. Оптимальные условия лиофилизации могут существенно отличаться для микроорганизмов, относящихся к разным родам, видам, и даже штаммам, и должны подбираться индивидуально для конкретного объекта.

Целью данной работы являлось изучение жизнеспособности бактерий рода Bacillus при их хранении методом лиофилизации.

Объектами исследования являлись штаммы бацилл Bacillus megaterium БИМ B-176, БИМ В-364, БИМ В-365, БИМ В-366, Bacillus pumilis БИМ В-374 из фонда Белорусской коллекции непатогенных микроорганизмов.

При изучении выживаемости бацилл после длительного хранения (6-8 лет) методом лиофилизации установлено, что все штаммы сохранили высокую жизнеспособность. Наибольшую жизнеспособность сохранили

287

штаммы B. megaterium БИМ В-364 и БИМ В-365, наименьшую – B. megaterium БИМ В-366 (таблица 1).

Таблица 1 – Жизнеспособность штаммов бактерий рода Bacillus после длительного хранения методом лиофилизации

На модели штамма B. megaterium БИМ B-176 исследовано влияние состава протекторной среды, возраста культуры, температуры хранения, на жизнеспособность бацилл при их хранении методом лиофилизации.

Установлено, что максимальную выживаемость бацилл при лиофилизации обеспечивает пептонная вода. Эффективность других протекторных сред (обезжиренное молоко, сахароза) была незначительно ниже (таблица 2).

Изучение выживаемости B. megaterium БИМ B-176 после 1 месяца хранения при разных температурах показало, что бациллы сохраняют высокую жизнеспособность как при их хранении в условиях гипотермии (4 °С), так и при комнатной температуре (таблица 2).

Таблица 2 – Жизнеспособность B. megaterium БИМ B–176 после лиофилизации в зависимости от протекторной среды и температуры хранения

Показано, что для хранения методом лиофилизации целесообразно использовать 72-часовые культуры бацилл, которые характеризуются более высокими показателями выживаемости по сравнению с 24– и 48–часовыми культурами (таблица 3). Можно предположить, что культура B. megaterium БИМ B-176 в стационарной фазе роста обладает повышенной устойчивостью к лиофильному высушиванию из-за присутствия большего количества спор.

Таблица 3 – Жизнеспособность B. megaterium БИМ B–176 после лиофилизации в зависимости от возраста культуры

288

На основании полученных результатов можно сделать вывод, что хранение бактерий рода Bacillus методом лиофилизации обеспечивает их высокую выживаемость и является перспективным для хранения коллекционных культур данных микроорганизмов.

Литературные источники

1.Kellen, W. R. Bacillus sphaericus as a pathogen of mosquitoes / W. R. Kellen // Proc. Annu. Conf. Calif. – 1964. – Vol. – P. 32-37.

2.Суслова, М. Ю. Микроорганизмы в экосистемах озер, рек и водохранилищ. Изучение бактерий рода Bacillus: количество, распределение, видовой состав / М. Ю. Суслова, В. В. Парфенова. – Иркутск, 2003. – С. 172.

3.Schleifer, K. H. Peptidoglycan types of bacterial cell walls and their taxonomic implications / K. H. Schleifer, O. Kandler // Bacteriol. Rev. – 1972. –

Vol. 36. – P. 407-477.

4.Цуцаева, А.А. Методология разработки технологий криоконсервации промышленных штаммов микроорганизмов / А.А. Цуцаева, А.Е. Ананьина, Л.М. Балыбердина // Цитология. – 2004. – Т. 46, № 10. – С. 878-879.

Falkovskaya U.V.1, Sidorenko A.V.2, Novik G.I.2

PRESERVATION OF BACTERIA OF THE GENUS BACILLUS

BY FREEZE-DRYING

1International Sakharov Environmental University, Minsk

2Institute of Microbiology, National Academy of Sciences, Minsk

Summary

The viability of bacteria of the genus Bacillus after preservation by freeze-drying, and the dependence of survival on the tread environment, age, culture and storage conditions were studied. It was found, that the bacilli retain high viability during the preservation in the freezedrying state. It was shown, that the maximum survival of bacilli provides application as protector peptone water and the use for freeze-drying 72-hour cultures.

289

СЕРИЯ «АГРАРНЫЕ НАУКИ»

УДК 631.3:631.174

Бегун П.П., Лях А.А.

РАСЧЕТ ПОТРЕБНОЙ МОЩНОСТИ НА ПРИВОД ЛОПАСТНОГО БАРАБАНА ВЫРАВНИВАТЕЛЯ ПОТОКА МИНЕРАЛЬНЫХУДОБРЕНИЙ

РУП «НЦП НАН Беларуси по механизации сельского хозяйства», г. Минск, Республика Беларусь

Актуальность. Энергоемкость является одним из основных критериев при разработке и внедрении машин в производство. В связи с этим этому вопросу уделяется большое внимание. Удельный расход энергии обуславливает выбор того либо иного распределяющего рабочего органа, к тому же знание мощности необходимо для расчета привода.

Рядом авторов были предложены аналитические зависимости для расчета мощности, необходимой для привода распределяющих устройств, однако их применимость для нашего случая весьма ограничена. Применение обобщенных выражений для расчета потребной мощности на привод лопастного барабана может привести к большим погрешностям при вычислении, ввиду разного их функционального назначения. Поэтому целью данной работы является вывод зависимости для определения потребной мощности на отбрасывание минеральных удобрений лопастным барабаном.

Основная часть Процессы, происходящие во время работы лопастного барабана сложны и поэтому их всесторонний учет затруднителен. Ниже приводится метод расчета потребной мощности, базирующийся на учете наиболее существенных сопротивлений и при определенных допущениях.

Анализ работы лопастного барабана показывает, что суммарную мощность, можно представить в виде суммы следующих составляющих:

Nб N1 N2 N3 N4 ,

где N1 – мощность, расходуемая на сообщение частицам кинетической энергии при их отбрасывании на выравнивающий транспортер, кВт;

N2 – мощность, необходимая на преодоление сил трения удобрений о лопасть, кВт;

N3– расход мощности на удар частиц удобрений о лопатку, кВт; N4 – мощность на преодоление сопротивлений вращению

лопастного барабана, кВт.

Работа, затрачиваемая на сообщение кинетической энергии массе удобрений m0 , достигнувшей наружного радиуса барабана после

соприкосновения с лопаткой, определяется по формуле:

290