Научные стремления 2012-1

маршрутов практически не включают я локальные объекты лесорекреационной территориальной системы в экскурсионный показ. Поэтому встает проблема введения специальной должности в соответствующих субъектах рекреационного лесопользования, в обязанности которой бы входила разработка мероприятий по использованию лесорекреационного потенциала и система маркетинговых мероприятий по их продвижению на рынок.

Литературные источники

1 Колбовский, Е. Ю. Экологический туризм и экология туризма / Е. Ю. Колбовский.

– 2-е изд., стереотипное. – Москва : Академия, 2008. – 253 с.

2 Постановление СМ РБ 3 ноября 2010 г. № 1626 «Об утверждении Государственной программы развития лесного хозяйства Республики Беларусь на 2011–2015 годы. Изменения и дополнения: Постановление Совета Министров Республики Беларусь от 1 августа 2011 г. № 1033 (Национальный реестр правовых актов Республики Беларусь, 2011 г., № 88, 5/34245).

3 Рожков, Л. Н. Методика эстетической оценки пейзажей // Лесное хозяйство, 1978.

– № 12. – С. 23-26.

4 Романов, В. С. Рожков, Л. Н. О рекреационных лесах // Лесное хозяйство, 1975. – № 9. – С. 27-30.

5 Постановление СМ РБ, № 1502 от 29.09.1999 г. «О Концепции устойчивого развития лесного хозяйства до 2015 год».

Gajdash E.A.

ESTIMATION OF RECREATIONAL POTENTIAL OF WOODS OF THE GOMEL REGION

«Belarus state pedagogical university», Minsk

Summary

Introduced the concept and the proposed wording of forest recreation territorial system, developed a method of assessing the capacity of the forest, on the basis of theoretical generalizations developed a classification of forest recreation territorial system, first established by the territorial differentiation of the recreational potential of forests and the Gomel oblast on the basis of a comprehensive assessment conducted its zoning, the analysis of key issues and directions of development of recreation and tourism of the Gomel region (using a SWOTanalysis).

231

УДК 579.873.13

Герасимович А.Д., Ананьева И.Н., Новик Г.И.

ОТРАБОТКА ПАРАМЕТРОВ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ БАКТЕРИОФАГА BV-45 В ФЕРМЕНТЕРАХ С ЦЕЛЬЮ ПОЛУЧЕНИЯ

ПРЕПАРАТА ДЛЯ БОРЬБЫ С БАКТЕРИОЗАМИ РАСТЕНИЙ

Институт микробиологии НАН Беларуси, Минск

Введение. Бактерии рода Pseudomonas являются разнообразной по значению и функциям группой микроорганизмов, занимающих обширную экологическую нишу. Фитопатогенные бактерии P. fluorescens наносят большой экономический ущерб сельскохозяйственному производству, поражая бобовые, злаковые, овощные, плодовые и др. культуры, снижая урожай до 50 % с одновременным ухудшением качества продукции [1]. Широко развернувшаяся во второй половине 20-го столетия борьба с вредными микроорганизмами, путем использования синтетических пестицидов, привела к насыщению биосферы веществами, токсичными для человека, сельскохозяйственных животных, полезной фауны и флоры [2].

Биологические препараты благодаря избирательности действия и экологической безопасности обеспечивают возможность создания высокопродуктивных экосистем с управляемыми популяционными отношениями фитопатогенов и их антагонистов. Широкое внедрение биологических препаратов в сельское хозяйство позволит получить существенный экономический эффект за счет повышения урожая растений и качества сельскохозяйственной продукции. На сегодняшний день известно более 1000 микроорганизмов – потенциальных агентов биологической защиты

[3].

С помощью бактериофагов, специфичных к штаммам фитопатогенных бактерий, осуществляют профилактику и борьбу с бактериальными болезнями сельскохозяйственных растений. Препаратами на основе бактериофагов обрабатывают инфицированные семена, больные растения или почву, на которой выращиваются растения [4]. Использование биопрепаратов на основе бактериофагов в качестве средства борьбы с болезнями представляется более целесообразным, поскольку в структуре бактериофагов обнаруживаются литические ферменты, которые способны деградировать экзополисахаридный матрикс биопленок, образуемых микроорганизмами на поверхностях растений, и разрушать клеточную стенку самих бактерий. Благодаря этому, вирус легко проникает внутрь клетки, размножается там, лизирует бактерию, выходит наружу и поражает соседние клетки. Ввиду специфичности воздействия бактериофагов исключительно на бактериальные клетки, можно избежать повреждающего действия на растения при применении подобных препаратов [5]. Вместе с тем, по эффективности действия биологические препараты зачастую уступают химическим, что является сдерживающим фактором биологизации защитных мероприятий. В целях повышения конкурентоспособности биологических агентов представляется необходимым

232

проведение исследований по выяснению и обеспечению их физиологических потребностей, позволяющих достигнуть максимального количества фаговых частиц.

Материалы и методы. Объектом исследований являлся бактериофаг БИМ BV-45, активный в отношении бактерий Pseudomonas fluorescens БИМ В-582.

Для приготовления лизатов и культивирования P. fluorescens использовали питательный бульон на основе гидролизата кильки. Бактерии культивировали в жидкой среде на качалке при температуре 27 °C. Приготовление лизата бактериофагов фитопатогенных псевдомонад осуществляли путем добавления в колбу с 50 мл свежей стерильной среды 1 мл ночной культуры и инкубации на качалке в течение 1-3 часов для достижения бактериями логарифмической стадии роста. Далее клетки заражали бактериофагом с множественностью инфекции 1:10. Через 1,5-2 часа после наступления лизиса в колбу добавляли 3-4 мл хлороформа и инкубировали на качалке 5-10 минут, после чего лизат центрифугировали в течение 30 минут при 10000 g для удаления разрушенных бактерий.

Для культивирования фагов в ферментере АНКУМ-3М выращивали ночную культуру. В ферментер со стерильной питательной средой вносили посевной материал бактерии-хозяина (из расчета 5 % от объема среды) с оптической плотностью 0,8 – 1,0 (длина волны 590 нм). Культивирование проводили при 160 и 200 оборотах в минуту и аэрации 0,5, 1,0 и 1,5 л воздуха на 1 л среды в минуту, температуре 27 °С. Оптическую плотность культуры и титр бактерий измеряли сразу после добавления посевной материал бактерий P. fluorescens и через каждый час культивирования. Через 2-3 часа, когда оптическая плотность среды составляла ~0,2, а титр бактерий – 108 КОЕ/мл, в ферментер вносили бактериофаг с множественностью инфекции 1:10. Оптическую плотность среды и титр фага измеряли каждые 60 минут.

После наступления лизиса в лизат фага вносили 10 мл хлороформа и оставляли на сутки. Затем центрифугировали при 6000 об/мин в течение 30 минут и сливали в стерильные колбы.

Результаты и обсуждение. С целью отработки параметров культивирования бактериофага BV-45 в ферментерах исследовали влияние частоты вращения мешалки и уровня аэрации на интенсивность роста культуры-хозяина и скорость лизиса бактериальных клеток. Для определения оптимальной частоты вращения мешалки культивирование фага осуществляли при 160 и 200 об/мин при аэрации 0,5 л/л среды в минуту и температуре 27 °С.

В результате исследований было установлено, что частота вращения мешалки не оказывает существенного влияния на интенсивность роста бактерий и лизис фагом BV-45 (рисунок 1а, 1б). Так, при скорости вращения мешалки 200 об/мин через 3 часа культивирования титр бактерий составил 9,1×107 КОЕ/мл, а при 160 об/мин – 9,4×107 КОЕ/мл. Титр фагов после лизиса бактерий в обоих образцах составил 4,6×1010 БОЕ/мл и 4,3×1010 БОЕ/мл при

233

160 об/мин и 200 об/мин, соответственно. В целом бактерии лизировались за

30-40 минут.

а б

Рисунок 1 – а) Интенсивность накопления биомассы бактерий P. fluorescens; б) Скорость лизиса бактерий фагом BV-45

Для определения оптимального уровня аэрации культивирование фага осуществляли при 0,5, 1,0 и 1,5 л/л среды в минуту при скорости вращения мешалки 160 об/мин и температуре 27°С. В результате исследований было установлено, что уровень аэрации оказывает существенное влияние на интенсивность роста бактериальной культуры. Наибольшая скорость роста культуры отмечалась при уровнях аэрации 1,0 и 1,5 л/л среды в минуту, титр бактерий после 2 часов культивирования составил 1,9×108 КОЕ/мл и 1,6×108 КОЕ/мл, соответственно (рисунок 2а). Поэтому культивирование P. fluorescens экономически целесообразно проводить при аэрации 1,0 л/л среды в минуту.

Установлено, что уровень аэрации не оказывает влияния на скорость лизиса бактериальных клеток. Гибель клеток наступила в среднем через 30-60 минут после внесения фага в культуру. По окончании лизиса титр фага при 0,5, 1,0 и 1,5 л/л среды в минуту составил 2,3×1010 БОЕ/мл, 2,5×1010 БОЕ/мл и 1,8×1010 БОЕ/мл, соответственно (рисунок 2б).

Рисунок 2 – а) Интенсивность накопления биомассы бактерий P. fluorescens; б) Скорость лизиса бактерий фагом BV-45

Вывод. Исходя из полученных данных, можно заключить, что оптимальные условия культивирования P. fluorescens и фага BV-45 в ферментере достигаются при скорости вращения мешалки – 160 об/мин и

234

уровне аэрации – 1,0 л воздуха на 1 л среды в 1 минуту. Культивирование бактерий-хозяина и фага в оптимизированных условиях позволяет сократить время получения высокого титра фаговых частиц до 5 ч.

Литератураные источники

1.Simoes, M. Monitoring the e ects of biocide treatment of Pseudomonas

fluorescens formed under di erent flow regimes / M. Simoes, M. Pereira, M. J. Vieira // Water Sci. Technol. – 2003. – Vol. 47. – P. 217–223.

2.Simões M. Monitoring the effects of biocide treatment of Pseudomonas fluorescens formed under different flow regimes / M. Simões, M. Pereira, M.J. Vieira // Water Sci. and

Technol. – 2003. – Vol. 47. ¹ 5. – P. 217-223.

3.Интегрированная защита растений / под ред. Ю.Б.Фадеева, К.В. Новожилова.

–М., 1981. – С. 188-208.

4.Simões M. Monitoring the effects of biocide treatment of Pseudomonas fluorescens formed under different flow regimes / M. Simões, M. Pereira, M.J. Vieira // Water Sci. and

Technol. – 2003. – Vol. 47. ¹ 5. – P. 217-223.

5.Fischetti, V.A. Bacteriophage lysins as effective antibacterials / V.A. Fischetti // Curr. Opin. Microbiol. – 2008. – Vol.11. – p.393-400.

Herasimovich A.D., Ananyeva I.N., Novik G.I.

IMPROVING BIOREACTOR CULTIVATION CONDITIONS FOR BACTERIOPHAGE BV-45 FOR THE INDUSTRIAL PRODUCTION OF THE PREPARATION FOR FIGHT AGAINST PHYTOPATHOGENIC BACTERIA

Institute of Microbiology, National Academy of Sciences, Minsk

Summary

Growth intensity of phytopathogenic bacteria Pseudomonas fluorescens and lysis rate of bacteriophage BV-45 at various culture conditions was studied. Optimal bioreactor cultivation conditions for bacteria and phage BV-45 are mixing – 160 rpm and aeration – 1,0 L/L.

235

УДК 577.1: [615.3+632.95+547]

Гриневич С. В., Губич О. И., Шолух М. В.

ЭФФЕКТИВНОСТЬ ЗАЩИТЫ КЛЕТОК ПЕЧЕНИ АНАЛОГАМИ 11- ДЕЗОКСИ-ПРОСТАГЛАНДИНА Е1 ОТ ТОКCИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ХЛОРОФОРМА IN VITRO

Институт биофизики и клеточной инженерии НАН Беларуси, Минск Белорусский государственный университет, Минск

Актуальность. Данная работа направлена на исследование гепатопротекторных свойств новой коллекции синтетических простаноидов группы Е и их биохимической активности in vitro.

Цель работы. Изучение цитопротекторного действия аналогов 11- дезокси-простагландина Е1 и их биохимической активности на клеточной модели повреждения печени хлороформом. Объект исследования: синтетические простаноиды группы Е, модифицированные по α- и ω-цепям.

Материалы и методы исследования. Анализ функциональной активности простаноидов был выполнен с использованием природного ПГI2 и 12 синтетических аналогов 11-дезокси-ПГЕ1. В работе использовали метод одноэтапной нерециркуляционной неферментативной перфузии для выделения гепатоцитов из печени крыс, спектрофотометрические методы определения активности внутриклеточных ферментов, триеновых конъюгатов и сульфгидрильных групп, метод световой микроскопии, статистические методы [1, 4].

Результаты и обсуждение. Для проведения исследований нами была экспериментально подобрана относительно высокая доза токсиканта (0,14%), вызывающая значительное, зависимое от времени повреждение плазматических мембран и мембран митохондрий (оценка проводилась по выходу ЛДГ и ГДГ, соответственно). Индекс цитотоксичности для указанных ферментов, оцененный после 2 часов воздействия 0,14% хлороформа, составил 76,0±2,6% для ЛДГ; 40,5±0,68% для ГДГ. Наряду с этим, наблюдалось 13-кратное накопление триеновых конъюгатов в клеточных мембранах. Полученные результаты хорошо согласуются с данными литературы, свидетельствующими о наличии взаимосвязи между клеточной гибелью, индуцированной хлороформом, и интенсификацией в его присутствии перекисного окисления липидов, приводящего к потере митохондриального мембранного потенциала и снижения интенсивности метаболических процессов в культуре гепатоцитов [5, 6].

Для установления защитного действия простаноидов исследуемые аналоги в концентрациях 10-6 – 10-10 моль/л добавляли к опытным пробам через 30 минут после внесения 0,14% хлороформа в анализируемые образцы. На начальном этапе эффективность действия аналогов была оценена по их способности предотвращать повреждение плазматических мембран и снижать, таким образом, утечку ЛДГ. Среди исследованных аналогов достоверное защитное действие в данном тесте оказывали все исследованные соединения, кроме аналогов ЯК-32, ТЯ-240 и ТЯ-239. Причем, наиболее выраженным

236

защитным действием обладали соединения ТЯ-280, ЯК-83 и ТЯ-246, почти полностью снижавшие цитотоксический эффект хлороформа (рис. 1). Прочие соединения снижали повреждение плазматических мембран на 18-66%. Максимально эффективными концентрациями простаноидов оказались таковые, равные 10-6 – 10-8 моль/л. Превышение данных концентраций не только не оказывало цитопротекторного эффекта, но и вызывало некоторое усиление повреждения клеток, проявляющееся в увеличении выхода ЛДГ во внеклеточную среду. Ранее подобный эффект был описан некоторыми авторами для ПГI2, используемого в концентрациях, превышающих 10-7 моль/л [3].

Рисунок 1. Эффект простаноидов на высвобождение ЛДГ из гепатоцитов, индуцированное 0,14% хлороформом

Установлено, что по силе цитопротекторного действия, исследуемые соединения образуют следующий ряд эффективности: ТЯ-280 (-96,7% к

эффекту хлороформа) > ЯК-83 (-93,3%) > ТЯ-246 (-87,0%) > ТЯ-227 (-83,33%) > ТЯ-287 (-66,7%) = ТЯ-263 (-66,7%) > ТЯ-30 (-60,9%) > ПГI2 (-56,1%) > 11-

237

дезокси-ПГЕ1 (-51,5%) > силимарин (-40,1%) >> ЯК-109 (-18,7%) > ЯК-122 (-

12,2%) > ТЯ-239 (-8,7%) >> ЯК-32 = ТЯ-240 = 0.

Примечательно, что эффект аналогов ТЯ-280, ЯК-83, ТЯ-246, ТЯ-227, ТЯ-287, ТЯ-263 и ТЯ-30 не только достоверно превышал защитное действие их природного предшественника 11-дезокси-ПГЕ1, но и значительно превосходил защитные эффекты хорошо известных гепатопротекторов простаноидного (ПГI2) и флавоноидного (силимарин) типа.

Установлено также, что все исследованные соединения, кроме ТЯ-263, эффективно защищали митохондрии, снижая утечку ГДГ на 21-75% в концентрациях 10-7 – 10-8 моль/л (рис. 2).

Рисунок 2. Действие простаноидов на высвобождение ГДГ из гепатоцитов, индуцированное 0,14% хлороформом

Простаноиды использовали в максимально эффективных концентрациях 11-дезокси- ПГЕ1(10-6 моль/л); ЯК-83, ЯК-122, ТЯ-30, ТЯ-246, ТЯ-280 (10-7 моль/л); ПГI2, ЯК-109, ЯК-32, ТЯ-227,

ТЯ-239, ТЯ-240, ТЯ-263, ТЯ-287 (10-8 моль/л) .

*- различия достоверны по отношению к эффекту 0,14% хлороформа при р ≤ 0,05.

Для дальнейшего выявления механизма защитного действия простаноидов нами были отобраны соединения ТЯ-280, ЯК-83, ТЯ-246, ТЯ227, ТЯ-287, ТЯ-263, ТЯ-30, ПГI2 и 11-дезокси-ПГЕ1. Согласно данным ряда авторов, повреждение клеточных структур, вызванное действием хлороформа, может быть опосредовано его превращением цитохромами Р450 2Е1 и Р450 2В1/2 в свободнорадикальные продукты с последующим вовлечением их в перекисное окисление липидов (ПОЛ) плазматических и внутриклеточных мембран [2]. Таким образом, на следующем этапе работы мы остановились на определении способности простаноидов снижать интенсивность свободнорадикальных процессов в клетке в присутствии хлороформа. В качестве маркера оксидативного стресса использовалась степень накопления в мембранах гепатоцитов триеновых конъюгатов.

Как упоминалось выше, в присутствии 0,14% хлороформа уровень триеновых конъюгатов увеличивался в 13 раз. В то же время, при внесении в суспензию гепатоцитов природных ПГI2, 11-дезокси-ПГЕ1 и аналогов ТЯ-263, ТЯ-227, ТЯ-287 наблюдалось достоверное снижение данного показателя (рис.

3).

238

Полученные результаты позволяют предположить возможность реализации наблюдаемого цитопротекторного эффекта некоторых 11-дезокси- аналогов ПГЕ1 через снижение интенсивности свободнорадикальных процессов в клеточных мембранах.

Рисунок 3. Влияние простаноидов на уровень триеновых конъюгатов в мембранах гепатоцитов, обработанных 0,14% хлороформом

* - различия достоверны при р ≤ 0,05.

Достоверность эффектов простаноидов оценивалась по отношению к эффекту 0,14% хлороформа на уровне значимости р≤0,05.

Заключение. Проведенные исследования позволили установить, что максимально выраженными защитными свойствами обладают соединения ТЯ280, ЯК-83, ТЯ-246, ТЯ-227, характеризующиеся наличием С14- циклогександионового фрагмента или С4-пиридиловой группы и С15-фенила, соединенного в ω-цепи с изоксазольной группой. Замена фенильной структуры в ω-цепи на С15-пиридильную, как и замена оксогрупп в положениях 9 и 15 на гидроксигруппы приводила к снижению защитных свойств простаноидов (ТЯ-287, ТЯ-263, ТЯ-30). Структура данных соединений может быть взята за основу для создания простаноидов нового поколения, обладающих гепатопротекторной активностью.

Литературные источники

1.Костюк, В.А., Потапович А.И. и др. / В. А. Костюк, А. И. Потапович, Е. Ф Лунец // Вопросы мед. химии – 1984. –Т. 30, № 4 – С. 125-127.

2.Ammann, P., Laethem, C. L., Kedderis, et al. // Toxicol. Appl Pharvacol. 1998. Vol. 2. P. 217-225.

3.Bergmeyer, H.U., Gawehn, K. et al. Phosphatase acid / H.U. Bergmeyer, K. Gawehn, M. Grassl // Methods of enzymatic analysis. – New York, 1974. – P. 495-496.

4.Berry, M. N., Friend, D.S. High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells / M. N. Berry, D.S. Friend // J. Cell Biol. – 1969. – Vol. 43, №3. – P.506-520.

5.Chein, L. F., Brand, M. D. The effect of chloroform on mitochondrial energy transduction / L. F. Chein, M. D. Brand // Biochem. J. - 1996. - Vol. 320, № 5. - P. 837-845.

6.Harting, S., Fries, S., et al. Reduced mitochondrial membrane potential and metabolism correspond to acute chloroform toxicity of in vitro hepatocytes / S. Harting, S. Fries, R. R. Balcarcel // J. Appl Toxicol. - 2005. - Vol. 25, № 4. - P. 310-317.

Hrynevich S. V., Hubich O. I., Sholukh M. V.

239

THE EFFECTIVENESS PROTECTION BY 11-DEOXY-ANALOGS OF PROSTAGLANDIN E1 AGAINST CHLOROFORM TOXIC ACTION IN VITRO

Institute of biophysics and cell engineering National Academy of Sciences, Minsk, Belarus Belarusian State University, Minsk

Summary

The cytoprotective effects of 12 synthetic 11-deoxy-prostaglandin E1 analogs chloroform as a toxic agent were studied with isolated rat liver hepatocytes in vitro. It was determined that seven prostanoids, prossessing C14-cyclogexanedion or C4-pyridyl group in ω-chain, are able to decrease a toxic action of natural prostaglandin I2 and sylimarin. The extent prostanoids protective activity correlated with a decrease of triene conjugate formation in cellular membranes.

240