На пути к пониманию механизма действия фермента

Современный подход к исследованию механизма действия фермента включает примерно следующую последовательность событий

1. Выделение фермента до гомогенного состояния и определение последовательности аминокислот и пространственной структуры. Сравнение полученных основных структурных свойств фермента с аминокислотными последовательностями и пространственными структурами родственных белков, используя доступные компьютерные базы данных. Найденные последовательности аминокислот и данные о пространственной структуре уже имеющиеся в базах данных, касающиеся исследуемого фермента будут полезны для идентификации инвариантных остатков аминокислот выполняющих ведущую роль в структуре фермента и его функциональной активности.

2. Изучение кинетики и субстратной специфичности фермента, и идентификация ингибиторов.

3. Идентификация ключевых функциональных боковых цепей аминокислот, и проведение 'сайт-направленного мутагенеза', используя клонированный ген данного фермента, чтобы подтвердить важность этих ключевых остатков аминокислот:

• Являются ли они существенными для каталитической активности?

• Являются ли они важными для связывания субстрата?

• Являются ли они важными для стабильности пространственной структуры фермента?

4. Построение гипотезы из данных особенностей химической реакции и перестроек химических связей, происходящих во время катализа. Проверка этойгипотезы 'сайт-направленным мутагенезом' и методами идентификации промежуточных соединений, образующихся во время катализа.

5. Проверка полученных результатов в физиологических условиях. Изучение механизмов регуляции активности этого фермента, идентификация эффекторов, влияющих на активность и выяснение значения этих эффекторов в процессах жизнедеятельности клетки.

6. В медицинской биохимии на основании данных о роли фермента и механизме действия разработать методы исследования этого фермента в биологических жидкостях и исследовать влияние химических аналогов субстратов и регуляторов в качестве потенциальных лекарственных препаратов.

Ферменты – биологические катализаторы белковой природы

Термин фермент в настоящее время уже без всяких сомнений применяется к биологическим катализаторам белковой природы. Открытие рибозимов – молекул РНК с ферментативной активностью - представляет пока лишь единственное исключение из этого общего правила. Получено свыше 1000 кристаллических ферментов, структура многих из них изучена с помощью современных физико-химических методов. Лабораторный синтез рибонуклеазы и лизоцима лишь дополнительное доказательство их белковой природы.

Изучение отдельных метаболических реакций, промежуточных метаболитов, механизмов регуляции работы катализаторов проводится главным образом с использованием очищенных препаратов фермен­тов. Высокоочищенные препараты ферментов необходимо иметь также и для того, чтобы получить на­дежные данные о кинетике, кофакторах, активных центрах, о структуре и механизме действия фермен­тов.

Методы выделения и очистки ферментов - это методы выделения и очистки белков.

Очистка фермента начинается с выделения данного фермента из грубого клеточного экстракта, содержащего множество других компонентов. Небольшие молекулы удаляются диализом или гель-фильтрацией, нуклеиновые кислоты осаждаются путем добавления антибиотиков (стрептомицина) и т.д. Основная проблема—отделить нужный фер­мент от сотен химически и физически сходных бел­ков. Если контроль за выделяемым белком доставляет довольно много хлопот исследователю, о присутствии фермента и его количестве на всех этапах очистки можно следить по его активности. В общем виде под активностью понимают количество фермента или биологического материла, содержащего фермент, которое при определенных условиях катализирует в единицу времени превращение определенного количества реагента, называемого субстратом. Активность - это изменение количества субстрата под влиянием фермента в единицу времени. Под изменением субстрата понимают снижающееся в единицу времени количество субстрата или же увеличивающееся количество продукта. Понятие "активность фермента" по сути дела идентична понятию "скорость ферментативной" реакции. Ферментативная активность выражается в единицах активности. В связи с существованием различных систем единиц исчисления введена интернациональная (стандартная) единица активности. Она носит символ "U" (unit-единица) и определяется как 1 мкмоль субстрата/мин. В системе СИ в качестве единицы ферментативной активности используют "катал" (kat). Катал определяется как 1 моль/сек.

1kat = 1 моль/сек.

Размерность её слишком велика, на практике пользуются меньшими кратными значениями, начиная с нанокатала (нкат). Это одна миллиардная катала или 10^-9 кат. В сравнении с международной единицей следующее уравнение

1 U = 16,67 нкат

В практике лабораторий широко пользуются понятием удельная активность. Для этого числоcтандартных единиц пересчитывают на какую-либо единицу сравнения. Это может быть мг белка в пробе или объем исследуемой биологической жидкости. Определение активности ферментов широко распространено в любой современной клинической лаборатории.

При исследовании кинетики реакций используется и такое понятие как молекулярная активность. Она показывает, сколько молекул субстрата в секунду превращаются в продукт 1 молекулой фермента и используется для сравнительной характеристики активности нескольких ферментов.