Белки чувствительны к внешним воздействиям

Нарушение пространственной структуры белков называют денатурацией. При этом белок теряет все свои биологические и физико-химические свойства. Денатурация сопровождается разрывом связей, стабилизирующих "нативную" структуру белка. Как уже отмечалось выше, в основе стабилизации структуры белков основную роль играет слабое взаимодействие, поэтому денатурацию могут вызывать различные факторы: нагревание, облучение, механическое встряхивание, охлаждение, химическое воздействие. При денатурации, как правило, нарушается и растворимость белков, так как нарушение структуры приводит к появлению на поверхности большого числа гидрофобных групп, обычно упрятанных в центре белковой молекулы.

Первичная структура белка при денатурации не изменяется, что позволило показать возможность восстановления функций и структуры денатурированного белка, хотя в большинстве случаев денатурация является необратимым процессом. В лабораторной практике денатурация используется для депротеинизации биологических жидкостей. Факторы, вызывающие денатурацию, называют денатурирующими агентами. К ним можно отнести:

1. Нагревание и действие облучения высоких энергий (ультрафиолетовое, рентгеновское, нейтронное и т.д). В основе лежит возбуждение колебаний атомов, сопровождающееся разрывом связей.

2. Действие кислот и щелочей; изменяют диссоциацию групп, уменьшают число ионных связей.

3. Ионы тяжелых металлов. Образуют комплексные соединения с группами белка, что сопровождается разрывом слабого взаимодействия.

4. Восстановители - вызывают разрыв дисульфидных мостиков.

5. Мочевина, гуанидиний хлористый - формируют новые водородные связи и разрывают старые. Явление денатурации можно использовать и для качественного анализа присутствия белков в растворах. Для этого пользуются пробой с кипячением исследуемой жидкости после ее подкисления. Образующееся при этом помутнение связано с денатурацией белка. Часто используют и осаждение органическими кислотами: сульфосалициловой или трихлоруксусной.

Для определения количества белков используют разные подходы

Для количественного анализа белков можно использовать определение белкового азота. Для этого пробу сжигают при высокой температуре в присутствии серной кислоты и перекиси водорода (окислитель). Происходит минерализация, при этом азот в форме аммиака связывается серной кислотой (сульфат аммония). Количество сульфата аммония определяют или с реактивом Несслера, или после перегонки аммиака титрометрически.

Значительно чаще для количественного определения используют цветные реакции (биуретовую или реакцию на фенольные группы Lowry). Биуретовая реакция основана на том, что в щелочной среде ионы меди реагируют с пептидными группировками, образуя комплексные соединения, окрашенные в фиолетовый цвет. Интенсивность окраски фотометрируется. Сочетание биуретовой реакции и реакции на фенольные группировки используется в методе Lowry.

Для количественного определения индивидуальных белков в сложных смесях белков большой популярностью пользуются иммунологические методы. При взаимодействии белка со специфической антисывороткой образуется мутный раствор. Интенсивность помутнения может быть измерена колориметрическими методами.