2013

Мікробіологія харчових продуктів. Лабораторний практикум для студ. напряму підготовки 6.051701 "Харчові технології та інженерія" ден. та заоч. форм навчання / Уклад.: С.М. Тетеріна, Н.М.Грегірчак. – К.: НУХТ, 2013. – 97 с.

Рецензент: В.О.Красінько, канд. техн. наук, доц.

Укладачі: С.М. Тетеріна, канд. техн. наук Н.М.Грегірчак, канд. техн. наук

Відповідальний за випуск Т.П. Пирог, д-р біол. наук, проф.

2

ЗАХОДИ БЕЗПЕКИ

Заходи безпеки під час виконання лабораторних робіт з дисципліни ―Мікробіологія Харчових продуктів‖ збігаються з загальними положеннями ―Інструкції з техніки безпеки під час роботи в лабораторних приміщеннях кафедри біотехнології і мікробіології‖, узгодженої з начальником відділу охорони праці і техніки безпеки НУХТ та затвердженої ректором НУХТ.

Особливу увагу під час виконання лабораторних робіт треба приділяти розділу 3 названого видання, де визначаються правила безпеки під час роботи з електроприладами, а також із легкозаймистими та горючими рідинами.

ЛАБОРАТОРНА РОБОТА 1

Організація мікробіологічної лабораторії, правила роботи в лабораторії. Оптичний мікроскоп та правила роботи з ним. Техніка мікроскопії.

Мета роботи: полягає у засвоєнні правил роботи у мікробіологічній лабораторії та опануванні методів мікроскопічного аналізу.

Матеріали та обладнання: мікроскопи, спиртівки, сірники, мікробіологічні петлі (голки), комплекти предметних і покривних скелець; крапельниці з дистильованою водою; пробірки з картопляним та кукурудзяним крохмалем, цибуля, суспензія дріжджів.

Загальні відомості 1. Правила роботи у мікробіологічній лабораторії

Під час роботи у мікробіологічній лабораторії необхідно дотримуватись таких правил:

1.Не заходити до лабораторії у верхньому одязі, працювати тільки в халаті.

2.Перед початком роботи переконатися в тому, що робочий стіл не захаращений різними предметами.

3.Під час роботи уникати метушні, не відчиняти і не зачиняти двері й вікна, оскільки це спричиняє переміщення повітря і зміну температури у різних частинах приміщення.

4.Дотримуватися чистоти і порядку в лабораторії: не палити, не їсти, не торкатися обличчя немитими руками, не кидати нічого на підлогу. Реактиви слід здавати черговому лаборанту.

5.Після закінчення заняття прибрати своє робоче місце і ретельно вимити руки.

6.Студенти і викладачі повинні зробити запис у спеціальному журналі про проведення інструктажу та ознайомлення з режимом роботи в лабораторії.

Примітка: Кожен студент працює на постійному місці, виконує завдання індивідуально. На робочому місці потрібно підтримувати зразковий порядок. Особисті речі повинні зберігатися в спеціально відведеному місці.

2.Правила техніки безпеки у мікробіологічній лабораторії

Умікробіологічній лабораторії необхідно підтримувати певний режим і дотримуватися таких застережних заходів:

3

1.Працювати у чистих білих халатах і шапочках або хустинках, волосся має бути підібраним. Слід мати індивідуальний рушник або серветки для витирання рук.

2.Пробірки та колби з культурами мікроорганізмів чітко підписувати чорнилом по склу. На склянках або крапельницях з реактивами і розчинами мають бути етикетки.

3.Під час роботи зі спиртівками слід остерігатись займання парів спирту. Не можна запалювати спиртівку від іншої палаючої спиртівки. Запалювати спиртівку можна лише сірниками, гасити полум'я – спеціальними ковпачками.

4.У разі займання ватних пробок на них не можна дмухати, оскільки це посилює горіння. Палаючі ватні пробки треба ввести у пробірки, колби або накрити зверху рушником (тканиною).

5.Мікробна маса не має забруднювати руки, стіл і оточуючі предмети. Петлі та голки після кожного контакту з мікроорганізмами слід прожарювати у полум’ї спиртівки або газового пальника і ставити у спеціальний штатив. У разі випадкового потрапляння мікробного матеріалу на шкіру дослідника, або стіл чи підлогу пролиту мікробну завись необхідно знешкодити за допомогою дезінфікувальних засобів.

6.Предметні й покривні скельця, піпетки після роботи помістити у дезінфікувальний розчин, потім ретельно промити у проточній воді. Піпетки після цього простерилізувати.

7.Поверхню твердих середовищ з мікробами у пробірках і чашках Петрі залити дезінфікувальними розчинами, через добу середовище викинути, а посуд промити і простерилізувати. Посуд мити лише в гумових рукавицях.

8.Суворо дотримуватися правил роботи з апаратами, що працюють під тиском, напругою або при високій температурі.

9.Категорично забороняється виносити мікробні культури за межі лабораторного приміщення.

10.Необхідно дотримуватися особистої гігієни: ретельно дезінфікувати і мити руки з милом перед вживанням їжі і після закінчення роботи, для цього можна використовувати 1 %-й розчин дегміну або 70 %-й розчин етилового спирту.

3. ОРГАНІЗАЦІЯ МІКРОБІОЛОГІЧНОЇ ЛАБОРАТОРІЇ. БУДОВА МІКРОСКОПА, ТЕХНІКА МІКРОСКОПІЇ

3.1. Мікробіологічна лабораторія та її обладнання

Залежно від призначення мікробіологічна лабораторія (навчальна, виробнича, науково-дослідна) складається з кількох приміщень: кімнати для мікроскопічних робіт, біохімічної лабораторії, стерилізаційної, мийної та термостатної кімнат. Усі приміщення мають бути сухі, добре освітлені, оснащені вентиляцією, мати підведення газу, гарячої та холодної води.

Приміщення мікробіологічної лабораторії має виходити вікнами на північ або північний захід, оскільки для мікроскопії потрібне рівне розсіяне світло. Природна освітленість робочого приміщення має відповідати коефіцієнту 1:5. Стіну

4

фарбують олійною фарбою світлих кольорів, підлогу покривають лінолеумом або кахельною плиткою, які легко миються. Стіл для мікроскопа розміщують так, щоб світло падало зліва чи спереду. Поверхню стола покривають пластиком або лінолеумом, що полегшує його миття та дезінфекцію.

Умікробіологічній лабораторії двічі на день проводять вологе прибирання. Підлогу, стіни й меблі періодично пилососять і протирають дезінфікувальними розчинами: 2 – 3 %-м розчином соди (двовуглекислого натрію), 0,5 – 3 %-м розчином дегміну, 3 – 6 %-м розчином пероксиду водню з додаванням 0,5 %-го мийного засобу та ін. Двічі на місяць рекомендується приміщення опромінювати бактерицидними переносними лампами (ОБПс-415) – від 30 хв до кількох годин.

Деякі роботи з мікроорганізмами (пересіви чистих культур, виділення

мікроорганізмів та ін.) виконують у спеціальному ізольованому приміщенні – боксі площею 3 – 5 м2. його поділяють на дві частини: робоче приміщення й передбоксник, що виключає різку циркуляцію повітря та занесення мікроорганізмів ззовні. У боксі встановлюють стіл, стільці, газові пальники, підвішують або прикріплюють на висувному кронштейні бактерицидні лампи. Приміщення боксу періодично миють і дезінфікують, перед початком роботи протягом 30 – 60 хв опромінюють бактерицидними лампами. Бокси доцільно обладнувати системою припливної вентиляції повітря. Перш ніж потрапити у бокс повітря проходить через систему фільтрів для вилучення мікроорганізмів. У приміщеннях С і Д класів чистоти кратність обміну повітря становить 5 – 15

об’ємів повітря за годину, а максимальна концентрація життєздатних мікроорганізмів – 100 – 500 КУО у 1 м3. За відсутності ізольованого боксу можливе використання ламінарних боксів, обладнаних системами постачання стерильного повітря.

Біохімічну лабораторію обладнують хімічними столами, витяжними шафами, технічними та аналітичними вагами, фотоелектроколориметрами, рН-метрами та іншими необхідними приладами, холодильниками, шафами для посуду та хімічних реактивів.

Упрепараторській кімнаті встановлюють робочі столи, шафи для інструментарію, стерильного посуду, центрифуги, холодильники для зберігання чистих культур, термостати.

В окремій стерилізаційній кімнаті розміщують автоклави для стерилізації поживних середовищ і посуду, сушильні шафи, стерилізатори інструментів.

Мийну кімнату обладнують зручними раковинами з підведенням гарячої та холодної води, стелажами та шафами для сушіння посуду, плитами для приготування поживних середовищ, вагами, дистиляторами води.

Утермостатній кімнаті розміщують стелажі для встановлення засіяних колб і пробірок, на спеціальних фундаментах – ротаційні качалки.

Умікробіологічній лабораторії мають бути такі прилади, посуд, матеріали та інвентар:

термостати сухоповітряні або водяні для вирощування мікроорганізмів при постійній заданій температурі;

автоклави для стерилізації посуду, поживних середовищ та інших матеріалів насиченою парою під тиском;

5

сушильні шафи з терморегулятором для сушіння і стерилізації лабораторного посуду, для висушування різних матеріалів до постійної маси;

холодильники для зберігання музейних і робочих культур мікроорганізмів, поживних середовищ, реактивів і розчинів.

Центрифуги, рН-метри, рефрактометри, фотоелектроколориметри, спектрофотометри, фільтри Зейтца та інші бактеріальні фільтри, скляний посуд (пробірки біологічні, чашки Петрі, колби Ерленмейера, плоскодонні, конічні, мірні; піпетки градуйовані, піпетки Мора, пастерівські піпетки з відтягнутим капіляром, крапельниці, бюретки, лійки, циліндри, бюкси, склянки та ін.), інвентар (бактеріологічні петлі та голки, пінцети, ножиці, свердла для пробок, металічні циліндри для піпеток, штативи, вата, марля для виконання різних мікробіологічних робіт).

3.2.Організація робочого місця мікробіолога

Унавчальній лабораторії за кожним студентом закріплені постійне робоче місце і прилади. На лабораторному столі встановлено освітлювач для мікроскопа, спиртовий або газовий пальник, набір найчастіше вживаних барвників, бактеріологічні петлі та голки, штатив для пробірок, піпетки, предметні та покривні скельця, скляний мостик, ванночка для забарвлення препаратів, бутель з водою, дезінфікувальна рідина, фланелева (марлева) серветка, олівець для скла, імерсійна олія, фільтрувальний папір, нарізаний за розміром предметного скла, сірники.

Мікроскоп розміщують у спеціально обладнаній шафі або зберігають у сейфі. Робоче місце слід тримати в чистоті. Поверхню стола та рук перед початком і

по закінченні роботи треба протирати ватним тампоном, змоченим 1 %-м розчином дегміну, 70 %-м розчином етанолу.

3.3.Будова мікроскопа та методи мікроскопії

Вивчення морфології та будови клітин мікроорганізмів, розмір яких визначається здебільшого мікрометром (1 мкм = 0,001 мм), можливе лише за допомогою мікроскопів, які забезпечують збільшення досліджуваних об'єктів у сотні (світлові мікроскопи), десятки і навіть сотні тисяч разів (електронні мікроскопи).

Мікроскоп (від гр. місrоs – малий, sсорео – дивлюсь) – оптичний прилад, що дає можливість отримати збільшене зображення дрібних предметів та їх деталей. У даному разі мікроскоп слугує для вивчення живих і вбитих мікроорганізмів (забарвлених і незабарвлених). Найпоширеніші моделі біологічних мікроскопів, які допомагають досліджувати об’єкти у прохідному світлі: МБІ, МБР, „Мікромед‖, „Биолам" та ін.

Біологічний мікроскоп (рис.1) складається з двох частин – механічної та оптичної. Механічна частина мікроскопа має штатив, предметний столик, тубус з револьверною головкою, макро- і мікрометричний гвинти.

Нижня частина штатива є опорою мікроскопа 12 , верхня ( у формі дуги) – тубусотримачем 8 .

6

Рис. 1. Біологічний мікроскоп Биолам 70:

1 – дзеркало;2 – конденсор; 3 –предметний столик;4 – об'єктив; 5 – револьвер; 6 – окуляр; 7 – тубус; 8 – тубусотримач; 9 – гвинти для переміщення предметного столика; 10,11 – відповідно макрометричний і мікрометричний гвинти; 12 – основа штатива.

У верхній частині тубусотримача міститься револьвер 5, що обертається навколо своєї осі. У три-чотири отвори нижньої пластики револьвера вгвинчуються об’єктиви 4. Обертанням пластини револьвера будь-який об'єктив можна підвести під тубус, центрування об'єктива по осі мікроскопа точно фіксується пружиною.

Револьвер має гніздо для кріплення похилого чи вертикального тубуса 7. Похилий тубус можна повернути навколо вертикальної осі в будь-яке зручне положення і закріпити гвинтом. У нижній його частині розміщується призма, яка заломлює оптичну вісь мікроскопа під кутом 45° до горизонтальної площини. У верхній кінець тубуса вкладаються змінні окуляри 6.

Тубусотримач разом з тубусом можна переміщувати по вертикалі на 50 мм за допомогою механізму, змонтованого в основі штатива 12. Механізм приводять у дію обертанням макрометричного 10 і мікрометричного 11 гвинтів. Макрометричний гвинт використовують для швидкого переміщення тубуса в обидва боки (вгору і вниз) по оптичній осі мікроскопа і для початкового грубого наведення на фокус. Один його оберт відповідає лінійному переміщенню тубуса на

1 мм.

Мікрометричний гвинт призначений для тонкого фокусування. Повний оберт мікрометричного гвинта переміщує тубус на 0,1 мм. Барабан гвинта розділений на 50 поділок, кожна з них відповідає переміщенню тубуса на 0,002 мм (тобто 2 мкм). Мікрометричний гвинт дуже крихкий, тому з ним слід поводитися дуже обережно. При обертанні гвинта за годинниковою стрілкою тубусотримач мікроскопа (разом з окуляром і об'єктивами) опускається, проти годинникової стрілки – підіймається.

Предметний столик 3 мікроскопа має круглу чи прямокутну форму, в його центрі є отвір для проходження променів, які освітлюють препарат. Столик можна переміщувати в горизонтальній площині за допомогою двох гвинтів 9,

7

розміщенних праворуч і ліворуч. Столик має два затискачі для закріплення препарату. Під предметним столиком на штативі закріплено кронштейн конденсора, що переміщується у межах 20 мм за допомогою спеціального гвинта.

Оптична частина мікроскопа складається з освітлювального апарата, об’єктивів і окулярів.

Освітлювальний апарат міститься під предметним столиком. Він складається з дзеркала 1 і конденсора 2 з діафрагмою.

Дзеркало зафіксоване на основі штатива, має два боки (увігнутий і плоский) і використовується для спрямування променів світла на препарат. Увігнуте дзеркало збирає і концентрує в площині препарату пучок паралельних променів, що йдуть від джерела світла; при денному світлі зазвичай використовують плоский бік дзеркала.

Конденсор, закріплений над дзеркалом, складається з двох лінз: верхньої – плоско-опуклої, нижньої – двоопуклої. Плоский бік верхньої лінзи може бути піднятий так, що відстань між конденсором і предметним столиком мікроскопа дорівнюватиме 0,1 мм. Конденсор призначений для збирання паралельних променів, що йдуть від джерела світла і відбиваються дзеркалом, в одній точці – фокусі, яка має бути в площині препарату. Забарвлені мікроорганізми досліджують з піднятим угору конденсором, досягаючи у такий спосіб повного освітлення препарату. Незабарвлені мікроорганізми розглядають з опущеним конденсором: поле зору затемнюється, кут заломлення світлового променю у середовищі та мікроскопічному об’єкті не є одинаковим і клітини стають видимими.

Під конденсором містяться ірис-діафрагма і відкидна оправа для світлофільтра. Ірис-діафрагма потрібна для затримання зайвих променів світла і складається із сталевих пелюстків, її отвір можна розширити або звузити за допомогою важеля. Будова ірис-діафрагми нагадує зіницю ока. Якщо використовують забарвлені препарати або розсіяне світло, діафрагму розширюють, а у разі розглядання незабарвлених препаратів та при яскравому освітленні її звужують і поліпшують контрастність.

Об'єктив 4 складається з системи шліфованих лінз, склеєних канадським бальзамом і вміщених у металеву оправу. Одне з позначень, які є на оправі, відповідає ступеню власного збільшення об’єктива – 8х, 40х і 90х разів. Робочою лінзою об’єктива є передня – фронтальна. Збільшення об'єктива залежить від її фокусної відстані, і отже, від кривизни. Що більша кривизна лінзи, то коротша фокусна відстань і більше збільшення об'єктива. Цю обставину потрібно враховувати у практичній роботі: що більше збільшення дає об’єктив, то нижче слід опускати його над площиною препарату; що менше збільшення об'єктива, то вище його положення (при збільшенні 8х відстань від фронтальної лінзи до покривного скла дорівнює 18,2 мм).

Інші лінзи об'єктива (їх може бути 10 і більше) розміщені вище, як фронтальна. Вони мають різну кривизну поверхні і виготовлені зі стекол з різними оптичними властивостями. Ці лінзи називаються корекційними і призначені не для збільшення, а для отримання чіткішого зображення.

Зображення, отримане за допомогою лінз, має ряд недоліків – аберацій, найістотнішими з яких бувають сферична та хроматична. За сферичної аберації

8

кожна точка об'єктива має вигляд кружальця, тобто отримане зображення не чітке, а розмите; за хроматичної аберації зображення набуває нового забарвлення, якого в об'єктиві немає.

Об'єктиви, в яких сферична і хроматична аберації скориговані не повністю, називаються ахроматами. Вони містять до шести лінз і дають найчіткіше зображення в центрі. Краї поля зору часто бувають забарвлені в різні кольори спектра. Ахромати поширені завдяки своїй простоті і дешевизні.

Сучасні об'єктиви – апохромати складаються з 10 – 12 лінз. У них майже в 10 разів менша, ніж у ахроматів, хроматична похибка, а також отримується більш рівномірна чіткість зображення.

Крім власного збільшення, на металевій оправі об'єктивів зазначені її числові апертури (0,20; 0,65; 1,25). Числова апертура А визначається добутком синуса половини кута U , під яким світло може потрапити в об'єктив, на показник заломлення середовища n , яке межує з лінзою:

А=sin U × n (рис.2). Числову апертуру можна підвищити, якщо між фронтальною лінзою та об'єктом вмістити краплю рідини, показник заломлення якої буде більший ніж показник заломлення повітря (n=1).

Наприклад, якщо краплю води (n =1,3), гліцерину (n=1,4) або кедрової олії (n=1,515) наблизити до показника заломлення скла (n=1,52), промені, проходячи через середовища приблизно однакової густини, не заломлюються, збільшується sin U, який становить <1, чим досягається краще освітлення розглянутого об'єкта. Такі об'єктиви називають імерсійними. Вони відрізняються від сухих зовні: на їх оправі є чорна кругова нарізка. Крім того, на ній вигравійоване позначення: МІ– масляна імерсія.

Рис. 2 Схема проходження променів при різній величині кута u: A – об’єкт; O - об’єктив; α– кут отвору;

u - половина кута отвору.

У біологічному мікроскопі застосовуються два типи об'єктивів: сухі та імерсійні. Під час роботи з сухими об'єктивами (8× і 40×) між фронтальною лінзою і препаратом міститься повітряний прошарок: імерсійний об’єктив (90×) занурюють у краплю олії, яку наносять на покривне скло. Робота з таким об'єктивом вимагає обережності через дуже коротку фокусну відстань його фронтальної лінзи.

Окуляр 6 (див. рис. 3.1) має дві лінзи: очну (верхню) і збиральну (нижню). Окуляри мають власне збільшення в 5×, 7×, 10×, 12×, 15× і 20× разів, яке позначено на їхній оправі. Спеціальні, так звані компенсаційні, окуляри використовуються з апохроматами. Вони сконструйовані таким чином, що дають хроматичну похибку, обернену до залишкового хроматизму апохромата і тому таку, що її компенсує. На оправі компенсаційних окулярів є позначка "Комп.". В

9

окулярі між лінзами є неповна перегородка – діафрагма, яка відсікає крайові промені і робить зображення чіткішим.

У результаті поєднання лінз в об’єктиві та окулярі хід променів у мікроскопі дає остаточне зображення об’єкта, яке буває збільшеним, оберненим і уявним (рис. 3).

Е

А′

Рис.3. Схема утворення зображення у світловому мікроскопі: А – об’єкт; О – об’єктив; Е – окуляр; А' – зображення об’єкта А; Х– лінія зображення; Z– дійсне зображення

Загальне збільшення мікроскопа визначається добутком збільшення об’єктива на збільшення окуляра. Отже, застосовуючи різні комбінації окулярів і об’єктивів, можна збільшити досліджувані об’єкти в світловому мікроскопі у 80 (8х10) – 1350

(90х15) разів.

Чіткість отриманого зображення визначається роздільною здатністю мікроскопа, під якою розуміють мінімальну відстань між двома точками (двома штрихами), коли вони не зливаються в одну точку (лінію). Що більше роздільна здатність мікроскопа, то меншого розміру об’єкт можна побачити.

Роздільна здатність мікроскопа залежить від довжини хвилі використаного світла і суми числових апертур об’єктива і конденсора:

де – довжина хвилі використаного світла; А1, А2 – числові апертури відповідно об’єктива і конденсора.

Роздільна здатність неозброєного ока становить 200 мкм, тобто 0,2 мм. Покращити роздільну здатність мікроскопа можна у два способи: освітлюючи об’єкт ще більш короткохвильовими променями світла, наприклад ультрафіолетовими, або збільшуючи апертуру об’єктива і конденсора. Апертура об’єктива збільшується при його імерсії краще в кедровій олії. Апертуру конденсора можна також збільшити до 1,2, вміщуючи імерсійну олію між верхньою лінзою конденсора і нижньою поверхнею предметного скла.

Освітлювач – невід’ємна частина мікроскопа. У багатьох сучасних мікроскопах освітлювальний апарат разом з джерелом світла вмонтований в основу мікроскопа. У мікроскопів інших систем такого пристрою немає, тому в такому разі застосовують спеціальні освітлювачі.

10