1.3 Електрофорез у поліакриламідному гелі (пааг)

Поліакриламідний гель у вигляді підтримуючого середовища при проведенні електрофорезу використовував Раймонд і Вейнтрауб (S. Raymond and L. Weintraub) в 1959 році. Теорію методу розробили Орнштейн (Omstein L., 1964) і Дэвис (Davis В., 1964).

1.3.1 Полімеризація поліакриламідного гелю

Для одержання поліакриламідного гелю використовують акриламід і який-небудь агент, що утворює поперечні зшивки - звичайно N,N'- метиленбісакриламід (скорочено -бісакриламід).

Реакція полімеризації протікає за вільнорадикальним механізмом й вимагає наявності вільних радикалів акриламіду. У якості ініціаторів реакції полімеризації використовують речовини, що руйнуються з утворенням вільних радикалів, які потім взаємодіють із молекулами акриламіду й запускають (ініціюють) полімеризацію. Найбільше широко в якості ініціатора процесу полімеризації використовують персульфат амонію (NH₄-SO₄-SO₄-NH₄) або калію, що утворює у водному розчині за рахунок гемолітичного розриву зв'язку радикали (NH₄-SO₄*). Рибофлавін також може служити ініціатором полімеризації: при висвітленні його водного розчину денним світлом (445 нм) він приєднує водень і відновлюється до лейкорибофлавіну, який легко окиснюється розчиненим у воді киснем, утворюючи перекис водню. За рахунок розкладання перекису вивільняються гідроксильні радикали, що ініціюють ланцюгову реакцію полімеризації акриламіду. Оскільки реакція полімеризації акриламіду - повільний процес, то для прискорення процесу полімеризації як каталізатора звичайно використовують

N,N,N',N' – тетраметилетилендиамін (CH₃)₂-N-CH₂-CH₂-N-(СНз)₂ (ТЕМЕД).

Можливе використання наступних пар каталізаторів і ініціаторів:

1. Персульфат амонію + ТЕМЕД

2. Персульфат амонію + ДМАПН ( 3-диметиламінопропіоннітрил)

3. Рибофлавін + ТЕМЕД (фотополімеризація)

4. Перекис водню + сульфат заліза + аскорбінова кислота

2. Щільність гелю (розмір пор)

Для характеристики поліакриламідного гелю необхідно вказувати процентний вміст мономерів. Стандартно використовують наступні позначення:

Т - відсоткове відношення сумарної маси обох мономерів до обсягу розчину,

С - відсоткове відношення маси бісакриламіда до загальної маси обох мономерів. (Т = акриламід + мономер, що утворює зшивки) і кількість агента, що зшиває, у відсотках від загальної кількості мономерів (С):

Т = (а + b)/m • 100%

С = b/(а + b) • 100%

а - кількість акриламіду;

b - кількість мономеру, що утворює зшивки (бісакриламіду);

Т - об’єм буферу, мл.

Т звичайно варіює в межах 3-30%, а С 1-5%. Вибір значень С и Т визначається діапазоном фракціонування білків і обмежується механічними й адсорбційними властивостями гелю. Для крупнопористих гелів необхідно збільшувати ступінь зшивки (підвищувати С до 3-5%), для дрібнопористих гелів величина С не повинна перевищувати 1-2%.

На перший погляд чим більше Т, тем дрібніше пори, але це не завжди так, оскільки ПААГ не є регулярними просторовими ґратами із твердими гніздами певного середнього розміру. При малих значеннях С він являє собою скоріше довгі нитки, що заповнюють увесь обсяг і лише в окремих точках випадково зшиті між собою. Така система не може бути внутрішньо твердою. Тому мігруючі в гелі макромолекули, очевидно, можуть розсовувати гнучкі довгі ділянки лінійних полімерів акриламіду, при цьому міграція молекул уповільнюється й відбувається своєрідне тертя їх про гель. Однак жорстких обмежень на розмір мігруючих молекул така система не накладає, і це дуже суттєво.

Чим вище концентрація заполімеризованого акриламіду, тим менший розмір пор у гелі:

р = 1,5 d / √ с, де

р - розмір пор в ангстремах

с - об'ємна концентрація акриламіду

d - діаметр молекули акриламіду

Чим більше вміст акриламіду (а величина Т, в основному, визначається їм), тим густіше нитки полімеру, менше проміжки між ними й сильніше тертя. Збільшення вмісту «зшивки» (С) спочатку підвищує твердість гелю, тому що середня довжина вільних ділянок ниток зменшується. Тертя при цьому збільшується, а міграція біополімерів у гелі уповільнюється. Однак далі картина змінюється, експериментально показано, що зі збільшенням С вище 10% гальмуючий ефект гелю (при тих самих значеннях Т) послабляється. При С>15% гель поводиться як крупнопористий навіть при високих значеннях Т. Внутрішня структура гелю в цьому випадку набуває, очевидно, зовсім іншого характеру. Завдяки частим зшивкам енергійно вигідним і ймовірним є багаторазове зв'язування декількох паралельних ниток, що йдуть, у свого роду пучки, які також утворюють хаотично зшиту просторову сітку. Ця сітка виявляється дійсно твердою - нитки в пучках розсунути неможливо. Зате між пучками полімерних ниток утворюються досить великі порожнечі, заповнені рідкою фазою гелю, по яких можуть вільно мігрувати молекули біополімерів. Тому вміст зшивки С у гелі повинний бути в межах 2-5%.

Співвідношення між акриламідом, що й зшиває агентом визначають механічні й фізичні властивості гелю. Для гелів з концентрацією Т 5 - 15 % С рекомендується вибирати в межах 2-4 %. Для вибору С була запропонована наступна емпірична формула:

С(%) = 6,5-0,3 Т(%)

Бісакриламід, мг = 1300 / акриламід, г