микробиология шпоры / билет 12

Экзаменационный билет №12

1. Молекулярно-генетические детекции микроорганизмов (ДНК-зонды, полимеразная цепная реакция)

Метод ДНК-зондов основан на уникальном свойстве генетического материала организма — молекулы ДНК, состоящей из мононуклеотидов, образовывать двойную спираль путем комплементарного соединения азотистых оснований. Молекула ДНК образует двойную спираль, при которой азотистые основания первой цепи строго комплементарно соединяются с азотистыми оснваниями второй, где аденин соединяется с тимином, гуанин — с цитозином.

Поскольку исходные одноцепочные молекулы могут происходить из разных источников, этот процесс удвоения молекул называется молекулярной гибридизацией. Нагрев материала, содержащего двухцепочные ДНК, до 80С или обработка его щелочью приводят к разделению двухцепочных молекул на одноцепочные, что называется денатурацией.

Современный ДНК-зонд, представляет собой нуклеотидную последовательность ограниченного размера, которая комплементарна определенному участку ядерной ДНК исследуемого цитогенетического препарата.

Кратко метод ДНК-зондов сводится к следующему:

1. Получение одноцепочного фрагемента ДНК определенного микроорганизма (ДНК-зонда) и его метка (изотопами, биотином, флуорохромами)

2. Выделение из патологического материала нуклеиновых кислот и их денатурация

3. Контакт образовавшихся ДНК с ДНК-зондом при температуре 55С, приводящий к образованию двухцепочных молекул (молекулярная гибридизация) в случаях их взаимной комплементарности.

4. Удаление всех негибридизированных одноцепочных молекул нуклеиновых кислот.

5. Обнаружение (по метке) образовавшихся двухцепочных молекул нуклеиновых кислот, которые и будут указывать на наличие в материале того или иного микроорганизма, на который был получен ДНК-зонд.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) основана на размножении в пробирках уникальных участков генов бактерии в миллионы и миллиарды раз за 2-3 часа при помощифермента термостабильной ДНК-полимеразы.

ПЦР основана на амплификации (процесс образования дополнительных копий участков ДНК) ДНК с помощью ДНК-полимеразы, осуществляющей синтез взаимнокомплементарных цепейДНК, начиная с двух праймеров. Праймеры комплементарны противоположным цепям ДНК в участках, ограничивающих выбранную область ДНК. При синтезе ДНК праймеры физически встраиваются в цепь новосинтезирующихся молекул. Т.о ПЦР состоит из стадий:

1. денатурации ДНК (плавление при 94-96С)

2. комплементарного связывания праймера с ДНК-матрицей (отжиг)

3. синтез ДНК с помощью ДНК-полимеразы (достройка праймера или синтез)

Этот стандартный цикл вопсроизводится многократно.

Праймеры для ПЦР имеют длину 20-30 нуклеотидов.Выбранный праймер должен быть комплементарен выбранному месту в матрице.

Также в реакции используются четыре типа дезоксинуклеозидтрифосфатов (дАТФ, дТТФ, дГТФ и дЦТФ), магний, буферный раствор и минеральной масло.

2. Неспецифические факторы защиты макроорганизма

Неспецифический (естественный) противомикробный иммунитет обеспечивают анатомо-физиологические, гуморальный и клеточные факторы.

1. анатомо-физиологические факторы резистентности:

- кожно-слизистые барьеры — являются механическим барьером, обладают также стерилизующей функцией; происходит также слущивание эпителиальных клеток, и тем самым удаление патогенной микрофлоты. Бактерицидное действие кожи обусловлено секретами потовых и сальных желез, а также содержащимися в коже жирными кислотами

- секреты желез пищеварительного тракта — обладают способностью обезвреживать многих болезнетворных микробов (слюна, желудочный сок, желчь)

- воспаление — сложная сосудисто-тканевая защитно-приспособительная реакция организма на действие раздражителя. Воспаление выполняет защиту организма от воздействия фактора в виде специфических реакций — фагоцитоза и выработки антител. Благодаря воспалительной реакции фокус повреждения ограничивается от всего остального организма.

- лимфатическая система — лимфоузлы играют роль своеобразных фильтров, которые задерживают микробные клетки и другие нерастворимые частицы

2. гуморальные факторы неспецифической резистентности:

- антитела — возникают в результате иммунизации различными микроорганизмами

- лизоцим — лизосомальный фермент присутствует в слезах, слюне,секрете слизистых, сыворотке; он устойчив к нагреванию и обладает свойством лизировать живые и убитые в основном грамположительные микроорганизмы

- секреторный иммуноглобулин А — постоянно присутствует в содержимом секретов слизистых, в кишечном тракте; обладает выраженными противомикробными и противовирусными свойствами

- пропердин — сывороточный белок, принимает участие в разрушении микробной клетки, нейтрализации вирусов. Нативный пропердин играет значительную роль в неспецифической активации комплемента.

-лизины — белки сыворотки, способные лизировать некоторые бактерии и эритроциты.

- лактоферрин — негеминовые гликопротеид, обладающийжелезосвязывающей активностью. Это фактор местного иммунитета,защищающий от микробов эпителиальные покровы.

- комплемент — многокомпонентная система белков сыворотки крови и других жидкостей организма, которые играют важную роль в поддержании иммунного гомеостаза. Система комплемента состоит из не менее чем девяти белков сыворотки крови, обозначаемых С1-С9. Система комплемента служит эффективным механизмом защиты организма, которая активируется в результате иммунных реакций или при непосредственном контакте с микробами или токсинами. Он повреждает клеточную стенку, а затем и лизирует клетку бактерии.

- интерферон — усиливает цитотоксическое действие сенсибилизированных лимфоцитов,оказывает антрипролиферативное и противоопухолевое действие, индуцирует активность макрофагов.

- бактерицидная активность сыворотки крови — понятие, объединяющее в себе антитела, лизоцим, пропердин, коммплемент и т. п.

- защитно-адаптационные механизмы (стресс) — выделение АКТГ,выделение противовоспалительного гормона типа кортизола и пр.

3. клеточные факторы неспецифической резистентности:

- фагоцитоз — наиболее древний механизм — процесс активного поглощения клетками организма попадающих в него патогенных живых или убитых микробов и других чужеродных частиц с последующим перевариванием при помощи внутриклеточных ферментов. Фагоцитирующие клетки делят на мирокфаги (или фагоциты) и макрофаги ( или мононуклеарные фагоциты). Процесс фагоцитоза включает в себя хемотаксис и адгезиючастиц к поверхности фагоцитов, постепенный захват частиц в клетку с последующим отделением части клеточной мембраны и образованием фагосомы,слияние фагосомы с лизосомами и ферментативное переваривание захваченных частиц и удаление оставшихся микробных элементов.

3. Возбудитель ботулизма.

Ботулизм — остро текущий кормовой токсикоз, возникающий вследствие поедания кормов, содержащих токсин возбудителя. Заболевание проявляется параличом мышц глотки, языка,нижней челюсти и скелетных мышц. К ботулизму восприимчивы многие виды животных, в том числе птицы, а также человек. Из лабораторных животных — белые мыши и морские свинки.

Возбудитель — Clostridium botulinum — анаэробная грамположительная спорообразующая палочка рода клостридий.

C. Botulinum обитает в почве. Заболеваемость ботулизмом повсеместна. Наиболее распространены бактерии типа A и B. В природных условиях бактерии колонизируют ил на дне водоёмов, инфицируют рыб. При пересыхании водоёмов рост C. Botulinum стимулируется. Таким образом,естественный резервуар для этих бактерий — почва и различные животные. Тёплый климат создаёт условия для длительного сохранения спор в почве, а также для прорастания и размножения вегетативных форм. Это крупные палочки с закруглёнными концами, споры расположены субтерминально. Подвижны, грамположительны, капсулу не образуют.

Строгий анаэроб, срок культивирования 48—72 ч. На мясо-пептонном бульоне — помутнение среды с газообразованием, характерный запах прогорклого масла. На кровяном МПА — колонии крупные с корневидными отростками и зоной гемолиза. Оптимальная кислотность для роста 7,3—7,6 (для прорастания спор 6,0—7,2).

Вид C. Botulinum образует экзотоксины, различающиеся по антигенным свойствам и по этому признаку подразделяются на серотипы. Ботулотоксины всех типов обладают сходной биологической активностью, являясь вариантами одного нейротоксина. Кроме нейротоксического действия, ботулотоксин обладает лейкотоксической, гемолитической и лецитиназной активностью. Попав вместе с пищей в желудочно-кишечный тракт, ботулотоксин прикрепляется к клеткам эпителия кишечника и путём пиноцитоза попадает в лимфатические сосуды, затем в кровь и далее проходит гематоэнцефалический барьер. В организме он распадается на 2 субкомпонента: L-лёгкий и Н-тяжёлый. Н-субкомпонент связывается сганглиозидами пресинаптической мембраны мотонейронов. L-субкомпонент, действуя как эндопротеаза, блокирует секрецию ацетилхолина, тем самым прерываются нервные импульсы, идущие от мотонейрона к мышце, что приводит к развитию вялых параличей. Ботулотоксин поражает мотонейроны спинальных моторных центров, продолговатого мозга и периферической нервной системы.

Основное направление при лабораторной диагностике ботулизма — обнаружение ботулинического токсина. Чтобы выделить культуру возбудителя, исследуемый материал высевают в два флакона со средой Китта-Тароци, один из них прогревают про 80С 1 час, затемоба инкубируют. Рост возбудителя характеризуется помутнением среды и газообразованием. У культуры отмечают специфический запах прогорклого масла. На 5-7е сутки инкубирования испытывают токсигенные свойства культуры методом биопробы.