Количественное определение общего белка в сыворотке крови биуретовым методом

Принцип метода: Ионы меди в щелочной среде реагируют с белком с образованием комплекса фиолетового цвета. Оптическая плотность образующегося комплекса прямо пропорциональна содержанию белка в пробе.

Линейность метода: 10 – 150 г/л.

Норма: 62 – 85 г/л.

Оборудование и реагенты:

1. Спектрофотометр с термостатированной кюветой, длина волны 540 нм, длина оптического пути 1 см; температура реакции 18-25С;

2. Секундомер;

3. Автоматические пипетки на 20 мкл и 1000 мкл;

4. Сыворотка крови;

5. Физиологический раствор;

6. Реагент (гидроксид натрия – 600 ммоль/л, калий-натрий тартрат – 32 ммоль/л, сульфат меди – 12 ммоль/л, иодид калия – 30 ммоль/л);

7. Калибратор – калибровочный раствор общего белка, 80,0 г/л.

Клинико-диагностическое значение.

Гипопротеинемия наблюдается при нефротическом синдроме, синдроме мальабсорбции, заболеваниях кожи (ожог, экзема), массивных кровотечениях, задержке солей и воды (заболевания почек), неправильном питании и голодании. Нарушением синтеза белка, приводящему к снижению его концентрации в сыворотке крови, сопровождаются раковая кахексия, длительные воспалительные процессы.

Гиперпротеинемия наблюдается при состояниях и болезнях, сопровождающихся дегидратацией организма (тяжелые травмы, понос, рвота, сахарный диабет). Она характерна также для хронических воспалительных заболеваний (ревматоидный артрит, диффузные болезни соединительной ткани – коллагенозы, цирроз печени) и острых воспалительных процессов в стадии острой фазы, наблюдается также при макроглобулинемии Вальденстрема.

Разделение белков сыворотки крови методом электрофореза на пленках из ацетата целлюлозы

Принцип метода: Белки являются амфотерными электролитами. Направление движения белков в электрическом поле зависит от рН среды. Коллоидные частицы белка перемещаются в электрическом поле постоянного тока к аноду – в щелочной среде, к катоду – в кислой среде.

Разделение белков сыворотки обычно проводят в буферном растворе при рН 8,6 – 8,9. В качестве носителя используют пленки из ацетата целлюлозы. В этих условиях заряженные белки сыворотки крови перемещаются по смоченным пленкам из ацетата целлюлозы в направлении анода со скоростью, зависящей от величины заряда и относительной молекулярной массы белка. Этот след представляет собой дорожку, на которой после окрашивания ясно видны места концентрации белков различных фракций. Наиболее быстро движутся альбумины, затем ₁-, ₂-, -глобулины, и, наконец, -глобулины. По этим следам (дорожкам) можно определить содержание белка в различных белковых фракциях пробы. Методом электрофореза на пленках из ацетата целлюлозы можно получить 5 и более белковых фракций.

Оборудование и реагенты:

1. Аппарат для электрофореза;

2. Источник постоянного тока;

3. Денситометр;

4. Веронал-мединаловый буфер, рН 8,6;

5. Раствор амидо черного для окрашивания электрофореграммы (амидо черный 250 мг в 100 мл 7% уксусной кислоты);

6. Раствор для отмывания (5-7% уксусная кислота)

7. Раствор для просветления пластинок из ацетата целлюлозы (смесь этанола, уксусной кислоты и глицерина);

8. Сыворотка крови;

9. Дистиллированная вода.

Просветления пластинок из ацетата целлюлозы можно достигнуть также, погрузив пластинки на 2-3 минуты в глицерин или вазелиновое масло.

Клинико-диагностическое значение: Электрофорез белков сыворотки крови имеет диагностическое значение в наблюдении за динамикой патологического процесса и оценке эффективности медикаментозного лечения.

Увеличение содержания -глобулинов в сыворотке характерно для острых воспалительных заболеваний, так ка в данную фракцию входят белки острой фазы.

Во фракцию -глобулинов входит также и большинство гликопротеинов крови. Поэтому ее содержание увеличивается при различных хронических заболеваниях, раке, травмах, ревматизме и инфаркте миокарда.

Повышение -глобулинов в сыворотке чаще наблюдается при гиперлипопротеинемиях различного происхождения, так как в эту фракцию входят липопротеины.

Фракция -Глобулинов состоит из иммуноглобулинов и увеличивается при заболеваниях, связанных с интенсивными иммунными процессами, а также при миеломных болезнях.

Гипогаммаглобулинемия может носить врожденный характер или быть обусловленной истощением иммунной системы (рак, хронические воспалительные процессы, аллергические заболевания, СПИД).

Определение общей активности креатинкиназы в сыворотке крови кинетическим методом

Принцип метода: Креатинкиназа (КК) катализирует обратимое фосфорилирование АДФ в присутствии креатинфосфата с образованием АТФ и креатина. Фермент гексокиназа (ГК) катализирует фосфорилирование глюкозы АТФ с образованием АДФ и глюкозо-6-фосфата. Затем глюкозо-6-фосфат под действием глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы (Г6ФДГ) окисляется до 6-фосфоглюконата с одновременным восстановлением НАД⁺ до НАДН.

Кинетическое спектрофотометрическое определение активности КК основано на регистрации возрастания оптической плотности анализируемой пробы при длине волны 340 нм. Скорость увеличения оптической плотности пробы при длине волны 340 нм прямо пропорциональна активности КК в ней.

Линейность метода: до 1500 Е/л.

Норма: мужчины – 0-160 Е/л (37С);

женщины – 0-130 Е/л (37С).

Оборудование и реагенты:

1. Спектрофотометр с термостатированной кюветой, длина волны 340 нм, длина оптического пути 1 см; температура реакции 37С;

2. Секундомер;

3. Автоматические пипетки на 25 мкл и 1000 мкл;

4. Сыворотка крови;

5. Дистиллированная вода;

6. Рабочий реагент (креатинфосфат – 30 ммоль/л, АДФ – 2,0 ммоль/л, D-глюкоза – 20 ммоль/л, НАД+ - 2,0 ммоль/л, ГК - > 2500 Е/л, Г6ФДГ - > 2000 Е/л, буфер (рН 6,70,1) – 100 ммоль/л).

Рабочий реагент годен для применения, если его оптическая плотность не выше 0,7 единиц оптической плотности при длине волны 340 нм.

Клинико-диагностическое значение: Повышение активности КК в сыворотке крови может быть следствием повреждения сердечной или скелетной мускулатуры.

При поражении сердечной мышцы (инфаркт миокарда, миокардит, сердечные аритмии, сердечная недостаточность) активность КК может вырасти в 20-30 раз по сравнению с нормой.

При поражении скелетной мускулатуры уровень активности КК возрастает еще больше.

При инфаркте миокарда, как правило, подъем активности КК наступает через 4-8 часов после начала болевого приступа, достигает максимума через 16-36 часов, и нормализуется к 3-6 дню. МВ-фракция КК является высокоспецифичной для сердечной мышцы, ее активность, как правило, значительно повышается при инфаркте миокарда.

Повышение активности КК может быть вызвано и другими причинами, например: употреблением алкоголя, отравлением снотворным, внутривенным введением ряда лекарственных препаратов.

Определение концентрации глюкозы в крови ферментативным методом (с помощью прибора контроля уровня глюкозы в крови ONE TOUCH BASIC PLUS)

Принцип метода: Система контроля уровня глюкозы в крови ONE TOUCH BASIC PLUS предназначена для определения уровня глюкозы в цельной крови в домашних и клинических условиях. Система включает в себя прибор ONE TOUCH BASIC PLUS, тест-полоски, ланцеты и флакон с контрольным раствором.

Тест основан на глюкозооксидазной реакции, специфичной для глюкозы. На любые другие сахара тест не реагирует. После нанесения крови на тест-полоску компоненты последней реагируют с кровью в следующей последовательности

Пероксид водорода реагирует с хромогеном (4-аминоантипирин) с образованием красителя хинонимина:

Интенсивность окраски пятна при длине волны 505 нм прямо пропорциональна концентрации глюкозы в нем.

Линейность метода: до 33,3 ммоль/л.

Норма:

Цельная кровь – 3,3-5,5 ммоль/л (18-25С);

Сыворотка – 3,8-6,1 ммоль/л.

Оборудование и реагенты:

1. прибор ONE TOUCH BASIC PLUS;

2. тест-полоски;

3. ланцеты;

4. Стандарт (контрольный раствор 4,8-6,8 ммоль/л).

Клинико-диагностическое значение: Увеличенные уровни глюкозы в крови (гипергликемия) характерны для сахарного диабета, гиперфункции щитовидной железы, гипофиза и надпочечников.

Концентрация глюкозы в крови ниже нормы (гипогликемия) наблюдается при инсулин-секретирующих опухолях, микседеме, гипофункции гипофиза, гипофункции надпочечников, и в случае введения пациенту сверхбольшой дозы инсулина.

Определение активности лактатдегидрогеназы в сыворотке крови кинетическим методом

Принцип метода: Лактатдегидрогеназа (ЛДГ) в сыворотке катализирует окисление молочной кислоты до пировиноградной кислоты с одновременным восстановлением НАД⁺ до НАДН.

Скорость увеличения оптической плотности раствора прямо пропорциональна активности ЛДГ в пробе и измеряется спектрофотометрически при длине волны 340 нм.

Линейность метода: до 800 Е/л.

Норма: мужчины – 80-285 Е/л (37С);

женщины – 103-227 Е/л (37С).

ЛДГ в негемолизированной сыворотке следует определять сразу после взятия крови. ЛДГ в сыворотке сохраняет стабильность при комнатной температуре (18-25С) в течение 2-3 дней. Не замораживать и не прогревать сыворотку до 37С!, поскольку при этом термолабильные изоэнзимы ЛДГ могут дезактивироваться.

Оборудование и реагенты: