Добавил:
Upload Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз: Предмет: Файл:
Гусейнов / Лекция 3.12 Рестриктазы н.docx
Скачиваний:
151
Добавлен:
10.06.2015
Размер:
713.28 Кб
Скачать

Проведение расщепления днк рестриктазами

Реакционная смесь обычно содержит 0,2-1 мкг ДНК в объеме 20 мкл или менее.

1. Добавьте воду к раствору ДНК в стерильной пробирке фирмы Эппендорф до объема 18 мкл и перемешайте.

2. Добавьте 2 мкл соответствующего буфера 10-кратной концентрации и перемешайте, слегка постукивая по пробирке пальцем.

3. Добавьте 1 ед. рестриктазы и перемешайте, слегка постукивая по пробирке пальцем. (1 ед. Фермента – это количество фермента, необходимое для полного расщепления 1 мкг ДНК за 1 ч в определенном буфере и при определенной температуре в объеме 20 мкл. Как правило, расщепление рестриктазами, проводимое в течение более длительных периодов времени или при избытке фермента, не приводит к осложнениям, если в препарате фермента отсутствуют примеси ДНКазы или экзонуклеазы. В имеющихся в продаже препаратах рестриктаз такие примеси обнаруживаются редко.)

4. Инкубируйте смесь при подходящей температуре в течение необходимого времени.

5. Остановите реакцию добавлением 0,5 М ЭДТА, рН 7,5, до конечной концентрации 10 мМ.

Если ДНК анализируют сразу в геле, добавьте 6 мкл красителя в буфере для нанесения I, перемешайте смесь встряхиванием и нанесите расщепленную ДНК на гель.

Если обработанная рестриктазой ДНК нуждается в очистке, экстрагируйте ее один раз смесью фенол-хлороформ, один раз хлороформом и осадите этанолом.

Примечания

Рестриктазы – дорогие ферменты! Связанные с ними затраты могут быть

сведены к минимуму, если следовать приведенным ниже правилам.

А. Чтобы отобрать небольшое количество фермента из упаковки с концентрированным раствором рестриктазы, быстро коснитесь кончиком стеклянной микропипетки разового пользования (на 5 мкл) поверхности раствора фермента. Таким способом можно отобрать всего 0,1 мкл раствора фермента.

Б. Рестриктазы стабильны при хранении при –20оС в буфере, содержащем 50% глицерин. При проведении расщепления ДНК растриктазами приготовьте реакционную смесь, содержащую все компоненты, кроме фермента. Достаньте из морозильника фермент и сразу же поместите его в лед. Работайте как можно быстрее, чтобы фермент находился вне морозильника минимальное время. Сразу же после использования поместите фермент обратно в морозильник.

В. Используйте минимальные объемы реакционной смеси, уменьшая в ней

количество воды, насколько это возможно. Проверьте, однако, чтобы объем внесенной рестриктазы составлял менее 1/10 конечного объема реакционной смеси, иначе активность фермента может ингибироваться глицерином.

Г. Когда ДНК необходимо обработать двумя или более рестриктазами, реакцию можно проводить одновременно при условии, что оба фермента функционируют в одном и том же буфере. В противном случае первым следует использовать фермент, функционирующий в буфере с более низкой ионной силой. После этого в реакционную смесь можно добавить необходимое количество соли и второй фермент (ферменты) и продолжить инкубацию.

Краткое описание некоторых ферментов рестрикции

Название

Aat II

Сайт узнавания

GACGTC CTGCAG

Источник

Из штамма E.coli несущего клонированный ген Aat II из Acetobacter aceti

Субстрат для определения активности

ДНК фага лямбда

Единица активности

За единицу активности принимается количество фермента, необходимое для гидролиза 1 мкг ДНК фага лямбда за 1 час при 37°С в 50 мкл реакционной смеси.

Оптимальный SE-буфер

Y (33 mM Tris-ацетат (pH 7.9 при 25°C); 10 mM магний-ацетат; 66 mM калий-ацетат; 1 mM DTT.)

Активность фермента в различных буферах в процентах от максимальной:

B

G

O

W

Y

10 - 25

25 - 50

10 - 25

25 - 50

100

Оптимальная температура

37oC

Условия хранения

10 mM Tris-HCl (pH 7.5); 50 mM NaCl; 0.1 mM EDTA; 200 ug/ml BSA; 1 mM DTT; 50% глицерин; Хранить при -20°С. Срок хранения фермента 1 год с даты проверки, указанной на фасовке

Лигирование

После гидролиза 10-кратным избытком фермента более 90% фрагментов ДНК сшиваются ДНК-лигазой и могут быть повторно расщеплены.

Неспецифический гидролиз

Картина специфического гидролиза не изменяется при обработке 1 мкг ДНК 10 ед фермента в течение 16 часов при 37°С.

Чувствительность к метилированию

не проверялось

Инактивация 20 мин при

65oC

Литература:

Sugisaki H., Maekawa Y., Kanazawa S., Takanami M. Nucleic Acid Res. 10:5747-5752(1982)

Теоретические электрофореграммы разделения фрагментов ДНК в 1%-ном агарозном геле 1хТБЕ для наиболее популярных плазмидных и вирусных ДНК:

Длины фрагментов на дорожке

13273, 10739, 9980, 1945

ДНК аденовируса-2

M

1

2

3

4

5

M

M - маркер, 1 - ДНК аденовируса-2, 2 - ДНК фага Лямбда, 3 - ДНК фага T7, 4 - pUC19, 5 - pBR322

Название

Bgl I

Кат. номера

E025

E026

Фасовки, е.а.

500

2500

Концентрация, е.а./мл

5000-10000

5000-10000

Цена, руб (без налогов)

700

2800

Добавить в корзину

Сайт узнавания

GCCNNNNNGGC CGGNNNNNCCG

Источник

Bacillus globigii

Субстрат для определения активности

ДНК фага лямбда

Единица активности

За единицу активности принимается количество фермента, необходимое для гидролиза 1 мкг ДНК фага лямбда за 1 час при 37°С в 50 мкл реакционной смеси.

Оптимальный SE-буфер

2W (20 mM Tris-HCl (pH 8,5 при 25°C); 10 mM MgCl2;; 200 mM NaCl; 1 mM DTT)

Активность фермента в различных буферах в процентах от максимальной:

B

G

O

W

Y

R

50 - 75

50 - 75

0 - 10

75 - 100

25 - 50

100

Оптимальная температура

37oC

Условия хранения

10 mM Tris-HCl (pH 7.5); 200 mM NaCl; 0.1 mM EDTA; 7 mM 2-меркаптоэтанол; 200 ug/ml BSA; 50% глицерин. Хранить при -20°C. Срок хранения фермента 1 год с даты проверки, указанной на фасовке

Лигирование

После гидролиза 10-кратным избытком фермента более 90% фрагментов ДНК сшиваются ДНК-лигазой и могут быть повторно расщеплены.

Неспецифический гидролиз

Картина специфического гидролиза не изменяется при обработке 1 мкг ДНК 10 ед фермента в течение 16 часов при 37°C. Большой избыток фермента приводит к появлению звездчатой активности

Чувствительность к метилированию

Не блокируется dсm-метилированием при перекрывании (CmCWGG): GCCWGGNNGGC

Инактивация 20 мин при

65oC

Примечание

Избыток фермента приводит к появлению звездчатой активности. С ферментом поставляется 10 Х SE-буфер 2W.

Название

Hinf I

Сайт узнавания

GANTC CTNAG

Источник

Из штамма E.coli несущего клонированный ген HinfI из Haemophilus influenzae

Субстрат для определения активности

ДНК фага лямбда

Единица активности

За единицу активности принимается количество фермента, необходимое для гидролиза 1 мкг ДНК фага лямбда за 1 час при 37°С в 50 мкл реакционной смеси.

Оптимальный SE-буфер

O (50 mM Tris-HCl (pH 7.6 при 25°C); 10 mM MgCl2; 100 mM NaCl; 1 mM DTT.)

Активность фермента в различных буферах в процентах от максимальной:

B

G

O

W

Y

25 - 50

75 - 100

100

75 - 100

75 - 100

Оптимальная температура

37oC

Условия хранения

10 mM Tris-HCl (pH 7.5); 50 mM NaCl; 0,1 mM EDTA; 1 mM DTT; 200 μg/ml BSA; 50% глицерин; Хранить при -20°С. Срок хранения фермента 1 год с даты проверки, указанной на фасовке

Лигирование

После гидролиза 20-кратным избытком фермента более 90% фрагментов ДНК сшиваются ДНК-лигазой и могут быть повторно расщеплены.

Неспецифический гидролиз

Картина специфического гидролиза не изменяется при обработке 1 мкг ДНК 40 ед фермента в течение 16 часов при 37°С.

Чувствительность к метилированию

не проверялось

Инактивация 20 мин при

80oC

Примечание

С ферментом поставляется 10 Х SE-буфер O.

Название

Hind III

  

Сайт узнавания

AAGCTT TTCGAA

Источник

Из штамма E.coli несущего клонированный ген HindIII из Haemophilus influenzae Rd

Субстрат для определения активности

ДНК фага лямбда

Единица активности

За единицу активности принимается количество фермента, необходимое для гидролиза 1 мкг ДНК фага лямбда за 1 час при 37°С в 50 мкл реакционной смеси.

Оптимальный SE-буфер

W (10 mM Tris-HCl (pH 8.5 при 25°C); 10 mM MgCl2; 100 mM NaCl; 1 mM DTT.) + BSA

Активность фермента в различных буферах в процентах от максимальной:

B

G

O

W

Y

10 - 25

25 - 50

0 - 10

100

0 - 10

Оптимальная температура

37oC

Условия хранения

10 mM Tris-HCl (pH 7.5); 250 mM NaCl; 0.1 mM EDTA; 200 μg/ml BSA; 7 mM 2-меркаптоэтанол; 50% глицерин; Хранить при -20°С. Срок хранения фермента 1 год с даты проверки, указанной на фасовке

Лигирование

После гидролиза 50-кратным избытком фермента более 90% фрагментов ДНК сшиваются ДНК-лигазой и могут быть повторно расщеплены.

Неспецифический гидролиз

Картина специфического гидролиза не изменяется при обработке 1 мкг ДНК 40 ед фермента в течение 16 часов при 37°С.

Чувствительность к метилированию

не проверялось

Инактивация 20 мин при

80oC

Примечание

Для достижения 100% активности BSA следует добавлять в реакционную смесь до концентрации 100 мкг/мл. С ферментом поставляется 10 Х SE-буфер W, BSA.

Литература:

Old, R., Murray, K., Roizes, G. J. Mol. Biol. 92: 331-339 (1975). В.А. Чернухин, М.А. Абдурашитов, В.Н. Томилов, Д.А. Гончар, С.Х. Дегтярев Сравнительный рестрикционный анализ хромосомной ДНК крысы in vitro и in silico // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю. А. Овчинникова, 2006, т. 2, №3, с. 39-46

Теоретические электрофореграммы разделения фрагментов ДНК в 1%-ном агарозном геле 1хТБЕ для наиболее популярных плазмидных и вирусных ДНК:

Длины фрагментов на дорожке

15000, 10000, 9000, 8000, 7000, 6000, 5000, 4000, 3000, 2000, 1000

Маркер

M

1

2

3

4

5

M

M - маркер, 1 - ДНК аденовируса-2, 2 - ДНК фага Лямбда, 3 - ДНК фага T7, 4 - pUC19, 5 - pBR322

Название

EcoR I

Сайт узнавания

GAATTC CTTAAG

Источник

Из штамма E.coli несущего клонированный ген EcoR I из Escherichia coli

Субстрат для определения активности

ДНК фага лямбда

Единица активности

За единицу активности принимается количество фермента, необходимое для гидролиза 1 мкг ДНК фага лямбда за 1 час при 37°С в 50 мкл реакционной смеси.

Оптимальный SE-буфер

SE-буфер EcoRI(100 mM Tris-HCl (pH 7.6 при 25°C); 10 mM MgCl2; 50 mM NaCl; 1 mM DTT.) +BSA

Активность фермента в различных буферах в процентах от максимальной:

B

G

O

W

Y

50 - 75

75 - 100

75 - 100

75 - 100

50 - 75

Оптимальная температура

37oC

Условия хранения

10 mM Tris-HCl (pH 7.5); 200 mM NaCl; 0.1 mM EDTA; 7 mM 2-меркаптоэтанол; 200 μg/ml BSA; 50% глицерин; Хранить при -20°С. Срок хранения фермента 1 год с даты проверки, указанной на фасовке

Лигирование

После гидролиза 40-кратным избытком фермента более 90% фрагментов ДНК сшиваются ДНК-лигазой и могут быть повторно расщеплены.

Неспецифический гидролиз

Картина специфического гидролиза не изменяется при обработке 1 мкг ДНК 40 ед фермента в течение 16 часов при 37°С.

Чувствительность к метилированию

не проверялось

Инактивация 20 мин при

65oC

Примечание

При большом избытке фермента, при использовании неоптимального буфера возможно появление звездчатой активности. Длительная инкубация c BSA не рекомендуется из-за появления звездчатой активности. Для достижения 100% активности BSA следует добавлять в реакционную смесь до концентрации 100 мкг/мл. С ферментом поставляется 10 Х SE-буфер EcoRI, BSA.

Литература:

Albertsen, H.M., Le Paslier, D., Abderrahim, H., Dausset, J., Cann, H., Cohen, D. Nucleiv Acids Res. 17: 808 (1989). В.А. Чернухин, М.А. Абдурашитов, В.Н. Томилов, Д.А. Гончар, С.Х. Дегтярев Сравнительный рестрикционный анализ хромосомной ДНК мыши in vitro и in silico// Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю. А. Овчинникова, 2007, 3, №4, с. 19-27.В.А. Чернухин, М.А. Абдурашитов, В.Н. Томилов, Д.А. Гончар, С.Х. Дегтярев Сравнительный рестрикционный анализ хромосомной ДНК крысы in vitro и in silico// Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю. А. Овчинникова, 2006, т. 2, №3, с. 39-46

Теоретические электрофореграммы разделения фрагментов ДНК в 1%-ном агарозном геле 1хТБЕ для наиболее популярных плазмидных и вирусных ДНК:

Длины фрагментов на дорожке

15000, 10000, 9000, 8000, 7000, 6000, 5000, 4000, 3000, 2000, 1000

Маркер

M

1

2

3

4

5

M

M- маркер,1- ДНК аденовируса-2,2- ДНК фага Лямбда,3- ДНК фага T7,4- pUC19,5- pBR322

Название

BamH I

Кат. номера

E021

E022

E021X

E022X

Фасовки, е.а.

4000

20000

4000

20000

Концентрация, е.а./мл

20000

20000

50000

50000

Цена, руб (без налогов)

750

3000

750

3000

Добавить в корзину

Сайт узнавания

GGATCC CCTAGG

Источник

Из штамма E.coli несущего клонированный ген BamHI из Bacillus amyloliquefaciens H

Субстрат для определения активности

ДНК фага лямбда

Единица активности

За единицу активности принимается количество фермента, необходимое для гидролиза 1 мкг ДНК фага лямбда за 1 час при 37°С в 50 мкл реакционной смеси.

Оптимальный SE-буфер

G (10 mM Tris-HCl (pH 7.6 при 25°C); 10 mM MgCl2; 50 mM NaCl; 1 mM DTT.) +BSA

Активность фермента в различных буферах в процентах от максимальной:

B

G

O

W

Y

R

25 - 50

100

75 - 100

75 - 100

25 - 50

100

Оптимальная температура

37oC

Условия хранения

10 mM Tris-HCl (pH 7.6); 50 mM NaCl; 0.1 mM EDTA; 100 μg/ml BSA; 1mM DTT; 50% глицерин; Хранить при -20°С. Срок хранения фермента 1 год с даты проверки, указанной на фасовке

Лигирование

После гидролиза 50-кратным избытком фермента более 90% фрагментов ДНК сшиваются ДНК-лигазой и могут быть повторно расщеплены.

Неспецифический гидролиз

Картина специфического гидролиза не изменяется при обработке 1 мкг ДНК 40 ед фермента в течение 16 часов при 37°С.

Чувствительность к метилированию

Не блокируется при перекрывании dam-метилированием (GmATC) :GGATCC.

Инактивация 20 мин при

65oC

Примечание

Большой избыток фермента приводит к появлению звездчатой активности. Для достижения 100% активности BSA следует добавлять в реакционную смесь до концентрации 100 мкг/мл. С ферментом поставляется 10 Х SE-буфер G, BSA.

Литература:

Wilson, G.A. and Young, F.E. J. Mol. Biol. 97: 123-125 (1975). Roberts, R.J., Wilson, G.A., Young, F.E. Nature 265: 82-84 (1977)

Построить диаграмму расщепления участка ДНК по Вашему выбору с помощью данной эндонуклеазы рестрикции. Введите в окно справа последовательность, состоящую из литер A, G, T, C и N длиной не менее 50 и не более 50 тысяч символов и нажмите кнопку Отправить

Начало формы

Конец формы

Теоретические электрофореграммы разделения фрагментов ДНК в 1%-ном агарозном геле 1хТБЕ для наиболее популярных плазмидных и вирусных ДНК:Для просмотра длин фрагментов наведите курсор на дорожку. Вы можете скопировать данные, если необходимо, из всплывающего окна

Длины фрагментов на дорожке

14332, 10679, 6203, 4723

ДНК аденовируса-2

Close

M

1

2

3

4

5

M

M- маркер,1- ДНК аденовируса-2,2- ДНК фага Лямбда,3- ДНК фага T7,4- pUC19,5- pBR322

Название

BamH I

Сайт узнавания

GGATCC CCTAGG

Источник

Из штамма E.coli несущего клонированный ген BamHI из Bacillus amyloliquefaciens H

Субстрат для определения активности

ДНК фага лямбда

Единица активности

За единицу активности принимается количество фермента, необходимое для гидролиза 1 мкг ДНК фага лямбда за 1 час при 37°С в 50 мкл реакционной смеси.

Оптимальный SE-буфер

G (10 mM Tris-HCl (pH 7.6 при 25°C); 10 mM MgCl2; 50 mM NaCl; 1 mM DTT.) +BSA

Активность фермента в различных буферах в процентах от максимальной:

B

G

O

W

Y

25 - 50

100

75 - 100

75 - 100

25 - 50

Оптимальная температура

37oC

Условия хранения

10 mM Tris-HCl (pH 7.6); 50 mM NaCl; 0.1 mM EDTA; 100 μg/ml BSA; 1mM DTT; 50% глицерин; Хранить при -20°С. Срок хранения фермента 1 год с даты проверки, указанной на фасовке

Лигирование

После гидролиза 50-кратным избытком фермента более 90% фрагментов ДНК сшиваются ДНК-лигазой и могут быть повторно расщеплены.

Неспецифический гидролиз

Картина специфического гидролиза не изменяется при обработке 1 мкг ДНК 40 ед фермента в течение 16 часов при 37°С.

Чувствительность к метилированию

Не блокируется при перекрывании dam-метилированием (GmATC) :GGATCC.

Инактивация 20 мин при

65oC

Примечание

Большой избыток фермента приводит к появлению звездчатой активности. Для достижения 100% активности BSA следует добавлять в реакционную смесь до концентрации 100 мкг/мл. С ферментом поставляется 10 Х SE-буфер G, BSA.

Литература:

Wilson, G.A. and Young, F.E. J. Mol. Biol. 97: 123-125 (1975). Roberts, R.J., Wilson, G.A., Young, F.E. Nature 265: 82-84 (1977)

Теоретические электрофореграммы разделения фрагментов ДНК в 1%-ном агарозном геле 1хТБЕ для наиболее популярных плазмидных и вирусных ДНК:

Длины фрагментов на дорожке

15000, 10000, 9000, 8000, 7000, 6000, 5000, 4000, 3000, 2000, 1000

Маркер

Длины фрагментов на дорожке

16841, 7233, 6771, 6527, 5626, 5504

ДНК фага Лямбда

M

1

2

3

4

5

M

M- маркер,1- ДНК аденовируса-2,2- ДНК фага Лямбда,3- ДНК фага T7,4- pUC19,5- pBR322

Теоретические электрофореграммы разделения фрагментов ДНК в 1%-ном агарозном геле 1хТБЕ для наиболее популярных плазмидных и вирусных ДНК:Длины фрагментов на дорожке

16841, 7233, 6771, 6527, 5626, 5504

ДНК фага Лямбда

M

1

2

3

4

5

M

M- маркер,1- ДНК аденовируса-2,2- ДНК фага Лямбда,3- ДНК фага T7,4- pUC19,5- pBR322

Теоретические электрофореграммы разделения фрагментов ДНК в 1%-ном агарозном геле 1хТБЕ для наиболее популярных плазмидных и вирусных ДНК:Длины фрагментов на дорожке

14332, 10679, 6203, 4723

ДНК аденовируса-2

M

1

2

3

4

5

M

M- маркер,1- ДНК аденовируса-2,2- ДНК фага Лямбда,3- ДНК фага T7,4- pUC19,5- pBR322

Теоретические электрофореграммы разделения фрагментов ДНК в 1%-ном агарозном геле 1хТБЕ для наиболее популярных плазмидных и вирусных ДНК:Длины фрагментов на дорожке

2686

PUC19

M

1

2

3

4

5

M

M- маркер,1- ДНК аденовируса-2,2- ДНК фага Лямбда,3- ДНК фага T7,4- pUC19,5- pBR322

Теоретические электрофореграммы разделения фрагментов ДНК в 1%-ном агарозном геле 1хТБЕ для наиболее популярных плазмидных и вирусных ДНК:Длины фрагментов на дорожке

4361

PBR322

M

1

2

3

4

5

M

M- маркер,1- ДНК аденовируса-2,2- ДНК фага Лямбда,3- ДНК фага T7,4- pUC19,5- pBR322

Название

Kpn I

Сайт узнавания

GGTACC CCATGG

Источник

Из штамма E.coli несущего клонированный ген KpnI из Klebsiella pneumonia

Субстрат для определения активности

ДНК фага лямбда

Единица активности

За единицу активности принимается количество фермента, необходимое для гидролиза 1 мкг ДНК фага лямбда за 1 час при 37°С в 50 мкл реакционной смеси.

Оптимальный SE-буфер

B (10 mM Tris-HCl (pH 7.6 при 25°C); 10 mM MgCl2; 1 mM DTT.) +BSA

Активность фермента в различных буферах в процентах от максимальной:

B

G

O

W

Y

100

25 - 50

25 - 50

25 - 50

75 - 100

Оптимальная температура

37oC

Условия хранения

10 mM Tris-HCl(pH 7.5); 50 mM NaCl; 0,1 mM EDTA; 200 μg/ml BSA; 1 mM DTT; 50% глицерин; Хранить при -20°С. Срок хранения фермента 1 год с даты проверки, указанной на фасовке

Лигирование

После гидролиза 20-кратным избытком фермента более 90% фрагментов ДНК сшиваются ДНК-лигазой и могут быть повторно расщеплены.

Неспецифический гидролиз

Картина cпецифического гидролиза не изменяется при обработке 1 мкг ДНК 20 ед фермента в течение 16 часов при 37°С.

Чувствительность к метилированию

Не блокируется при перекрывании Dсm-метилированием (CmCWGG):GGTACCWGG.

Инактивация 20 мин при

80oC

Примечание

Длительная инкубация с BSA не рекомендуется . Для достижения 100% активности BSA следует добавлять в реакционную смесь до концентрации 100 мкг/мл. С ферментом поставляется 10 Х SE-буфер B, BSA.

Литература:

Smith, D.I., Blattner, F.R., Davies, J. Nucleic Acids Res. 3: 343-353 (1976). Абдурашитов М. А, Чернухин В. А., Томилов В. Н., Гончар Д. А., Дегтярев С. Х. Рестрикционный анализ ДНК человека – новые возможности в ДНК-диагностике// Медицинская генетика, Т.6, № 8, с 29-36, 2007

Теоретические электрофореграммы разделения фрагментов ДНК в 1%-ном агарозном геле 1хТБЕ для наиболее популярных плазмидных и вирусных ДНК:Длины фрагментов на дорожке

15000, 10000, 9000, 8000, 7000, 6000, 5000, 4000, 3000, 2000, 1000

Маркер

M

1

2

3

4

5

M

M- маркер,1- ДНК аденовируса-2,2- ДНК фага Лямбда,3- ДНК фага T7,4- pUC19,5- pBR322

Название

EcoR V

Кат. номера

E059

E060

Фасовки, е.а.

2000

10000

Концентрация, е.а./мл

20000

20000

Цена, руб (без налогов)

630

2520

Добавить в корзину

Сайт узнавания

GATATC CTATAG

Источник

Из штамма Е.coli несущего клонированный ген EcoRV из Escherichia coli

Субстрат для определения активности

ДНК фага лямбда

Единица активности

За единицу активности принимается количество фермента, необходимое для гидролиза 1 мкг ДНК фага лямбда за 1 час при 37°С в 50 мкл реакционной смеси.

Оптимальный SE-буфер

W (10 mM Tris-HCl (pH 8.5 при 25°C); 10 mM MgCl2; 100 mM NaCl; 1 mM DTT.) + BSA

Активность фермента в различных буферах в процентах от максимальной:

B

G

O

W

Y

R

0 - 10

25 - 50

50 - 75

100

25 - 50

50

Оптимальная температура

37oC

Условия хранения

10 mM Tris-HCl (pH 7.5); 50 mM NaCl; 0,1 mM EDTA; 1 mM DTT; 200 μg/ml BSA; 50% глицерин;Хранить при -20°С. Срок хранения фермента 1 год с даты проверки, указанной на фасовке

Лигирование

После гидролиза 20-кратным избытком фермента более 90% фрагментов ДНК сшиваются ДНК-лигазой и могут быть повторно расщеплены.

Неспецифический гидролиз

Картина специфического гидролиза не изменяется при обработке 1 мкг ДНК 20 ед фермента в течение 16 часов при 37°С.

Чувствительность к метилированию

не проверялось

Инактивация 20 мин при

80oC

Примечание

Большой избыток фермента приводит к появлению звездчатой активности. Для достижения 100% активности BSA следует добавлять в реакционную смесь до концентрации 100 мкг/мл. Не рекомендуется использовать BSA при длительной инкубации. С ферментом поставляется 10 Х SE-буфер W, BSA.

Литература:

Холмина В., Ребентиш Б.A., Скоблов Ю.С., и др. Докл. Акад. Наук СССР 253: 495-497 (1980). В.А. Чернухин, М.А. Абдурашитов, В.Н. Томилов, Д.А. Гончар, С.Х. Дегтярев Сравнительный рестрикционный анализ хромосомной ДНК мыши in vitro и in silico // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю. А. Овчинникова, 2007, 3, №4, с. 19-27.

Построить диаграмму расщепления участка ДНК по Вашему выбору с помощью данной эндонуклеазы рестрикции. Введите в окно справа последовательность, состоящую из литер A, G, T, C и N длиной не менее 50 и не более 50 тысяч символов и нажмите кнопку Отправить

Начало формы

Конец формы

Теоретические электрофореграммы разделения фрагментов ДНК в 1%-ном агарозном геле 1хТБЕ для наиболее популярных плазмидных и вирусных ДНК: Для просмотра длин фрагментов наведите курсор на дорожку. Вы можете скопировать данные, если необходимо, из всплывающего окна

Длины фрагментов на дорожке

Close

M

1

2

3

4

5

M

M - маркер, 1 - ДНК аденовируса-2, 2 - ДНК фага Лямбда, 3 - ДНК фага T7, 4 - pUC19, 5 - pBR322

Название

Sal I

Кат. номера

E115

E116

Фасовки, е.а.

2000

10000

Концентрация, е.а./мл

20000

20000

Цена, руб (без налогов)

1680

6720

Добавить в корзину

Сайт узнавания

GTCGAC CAGCTG

Источник

Из штамма E.coli несущего клонированный ген Sal I из Streptomyces albus

Субстрат для определения активности

ДНК фага лямбда (HindIII-digest)

Единица активности

За единицу активности принимается количество фермента, необходимое для гидролиза 1 мкг ДНК фага лямбда (HindIII-digest) за 1 час при 37°С в 50 мкл реакционной смеси.

Оптимальный SE-буфер

O (50 mM Tris-HCl (pH 7.6 при 25°C); 10 mM MgCl2; 100 mM NaCl; 1 mM DTT.)

Активность фермента в различных буферах в процентах от максимальной:

B

G

O

W

Y

R

0 - 10

10 - 25

100

25 - 50

0 - 10

5

Оптимальная температура

37oC

Условия хранения

10 mM Tris-HCl (pH 7.5); 50 mM NaCl; 0,1 mM EDTA; 200 μg/ml BSA; 7 mM 2-меркаптоэтанол; 50% глицерин. Хранить при -20°С. Срок хранения фермента 1 год с даты проверки, указанной на фасовке

Лигирование

После гидролиза 10-кратным избытком фермента более 90% фрагментов ДНК pUC19 сшиваются ДНК-лигазой и могут быть повторно расщеплены.

Неспецифический гидролиз

Картина специфического гидролиза не изменяется при обработке 1 мкг ДНК 20 ед фермента в течение 16 часов при 37°С.

Чувствительность к метилированию

не проверялось

Инактивация 20 мин при

65oC

Примечание

Большой избыток фермента приводит к появлению звездчатой активности. С ферментом поставляется 10 Х SE-буфер O.

Литература:

Arrand, J.R., Myers, P.A., Roberts, R.J., J. Mol. Biol. 118: 113-122 (1978).

Построить диаграмму расщепления участка ДНК по Вашему выбору с помощью данной эндонуклеазы рестрикции. Введите в окно справа последовательность, состоящую из литер A, G, T, C и N длиной не менее 50 и не более 50 тысяч символов и нажмите кнопку Отправить

Начало формы

Конец формы

Теоретические электрофореграммы разделения фрагментов ДНК в 1%-ном агарозном геле 1хТБЕ для наиболее популярных плазмидных и вирусных ДНК:

Длины фрагментов на дорожке

32744, 15259, 499

ДНК фага Лямбда

M

1

2

3

4

5

M

M - маркер, 1 - ДНК аденовируса-2, 2 - ДНК фага Лямбда, 3 - ДНК фага T7, 4 - pUC19, 5 - pBR322

Название

BssT1 I

Кат. номера

E207

E208

Фасовки, е.а.

1000

5000

Концентрация, е.а./мл

10000-20000

10000-20000

Цена, руб (без налогов)

330

1320

Добавить в корзину

Сайт узнавания

CCWWGG GGWWCC

Источник

Bacillus stearothermophilus T1

Субстрат для определения активности

ДНК фага лямбда

Единица активности

За единицу активности принимается количество фермента, необходимое для гидролиза 1 мкг ДНК фага лямбда за 1 час при 60°С в 50 мкл реакционной смеси.

Оптимальный SE-буфер

2K (10 mM Tris-HCl (pH 7.6 при 25°C); 10 mM MgCl2; 200 mM KCl; 1 mM DTT.)

Активность фермента в различных буферах в процентах от максимальной:

B

G

O

W

Y

R

10 - 25

25 - 50

25 - 50

75 - 100

10 - 25

100

Оптимальная температура

60oC

Условия хранения

10 mM Tris-HCl (pH 7.5); 50 mM KCl; 0.1 mM EDTA; 7 mM 2-меркаптоэтанол; 200 ug/ml BSA; 50% глицерин; Хранить при -20°С. Срок хранения фермента 1 год с даты проверки, указанной на фасовке

Лигирование

После гидролиза 20-кратным избытком фермента более 90% фрагментов ДНК сшиваются ДНК-лигазой и могут быть повторно расщеплены.

Неспецифический гидролиз

Картина специфического гидролиза не изменяется при обработке 1 мкг ДНК 40 ед фермента в течение 16 часов при 60°С.

Чувствительность к метилированию

не проверялось

Инактивация 20 мин при

80oC

Примечание

Большой избыток фермента приводит к появлению звездчатой активности С ферментом поставляется 10 Х SE-буфер 2K

Литература:

Серов Г.Д., Терещенко T.A., Пучкова Л.И., Речкунова Н.И., Дегтярев С.Х., Неопубликованные данные.

Построить диаграмму расщепления участка ДНК по Вашему выбору с помощью данной эндонуклеазы рестрикции. Введите в окно справа последовательность, состоящую из литер A, G, T, C и N длиной не менее 50 и не более 50 тысяч символов и нажмите кнопку Отправить

Начало формы

Конец формы

Теоретические электрофореграммы разделения фрагментов ДНК в 1%-ном агарозном геле 1хТБЕ для наиболее популярных плазмидных и вирусных ДНК: Для просмотра длин фрагментов наведите курсор на дорожку. Вы можете скопировать данные, если необходимо, из всплывающего окна

Длины фрагментов на дорожке

15000, 10000, 9000, 8000, 7000, 6000, 5000, 4000, 3000, 2000, 1000

Маркер

Close

M

1

2

3

4

5

M

M - маркер, 1 - ДНК аденовируса-2, 2 - ДНК фага Лямбда, 3 - ДНК фага T7, 4 - pUC19, 5 - pBR322

Название

Erh I

Кат. номера

E061

E062

Фасовки, е.а.

1000

5000

Концентрация, е.а./мл

10000-50000

10000-50000

Цена, руб (без налогов)

420

1680

Добавить в корзину

Сайт узнавания

CCWWGG GGWWCC

Источник

Erwinia rhapontici

Субстрат для определения активности

ДНК фага лямбда

Единица активности

За единицу активности принимается количество фермента, необходимое для гидролиза 1 мкг ДНК фага лямбда за 1 час при 37°С в 50 мкл реакционной смеси.

Оптимальный SE-буфер

2W (20 mM Tris-HCl (pH 8,5 при 25°C); 10 mM MgCl2;; 200 mM NaCl; 1 mM DTT) + BSA

Активность фермента в различных буферах в процентах от максимальной:

B

G

O

W

Y

R

10 - 25

25 - 50

25 - 50

75 - 100

10 - 25

100

Оптимальная температура

37oC

Условия хранения

10 mM Tris-HCl (pH 7.5); 50 mM KCl; 0,1 mM EDTA; 200 ug/ml BSA; 7 mM 2-меркаптоэтанол; 50% глицерин; Хранить при -20°С. Срок хранения фермента 1 год с даты проверки, указанной на фасовке

Лигирование

После гидролиза 20-кратным избытком фермента более 90% фрагментов ДНК сшиваются ДНК-лигазой и могут быть повторно расщеплены.

Неспецифический гидролиз

Картина специфического гидролиза не изменяется при обработке 1 мкг ДНК 50 ед фермента в течение 16 часов при 37°С.

Чувствительность к метилированию

не проверялось

Инактивация 20 мин при

65oC

Примечание

Для достижения 100% активности BSA следует добавлять в реакционную смесь до концентрации 100 мкг/мл. С ферментом поставляется 10 Х SE-буфер 2W, BSA.

Литература:

Жилкина O.A., Речкунова Н.И., Семенченко Г.В., Дегтярев С.Х. Неопубликованные данные (1994).

Построить диаграмму расщепления участка ДНК по Вашему выбору с помощью данной эндонуклеазы рестрикции. Введите в окно справа последовательность, состоящую из литер A, G, T, C и N длиной не менее 50 и не более 50 тысяч символов и нажмите кнопку Отправить

Начало формы

Конец формы

Теоретические электрофореграммы разделения фрагментов ДНК в 1%-ном агарозном геле 1хТБЕ для наиболее популярных плазмидных и вирусных ДНК: Для просмотра длин фрагментов наведите курсор на дорожку. Вы можете скопировать данные, если необходимо, из всплывающего окна

Длины фрагментов на дорожке

19328, 7743, 6223, 4255, 3472, 2690, 1882, 1489, 925, 421, 74

ДНК фага Лямбда

Close

M

1

2

3

4

5

M

M - маркер, 1 - ДНК аденовируса-2, 2 - ДНК фага Лямбда, 3 - ДНК фага T7, 4 - pUC19, 5 - pBR322