Подготовка у универсиаде 2012 / Генетика (Жимулев) / 11ver7

Глава 11. Упаковка ДНК

Рисунок 11.1

в хромосомах

H2A

2 = 28000

H2B

2 = 28000

ВклеткахнебываетчистойДНК.Навсех

H3

2 = 30000

этапахклеточногоцикламолекулыДНКвтойили

H4

2 = 22000

200 ï.í. ÄÍÊ = 130000

иной степени упакованы в нуклеопротеиновые

Масса белка = 108000

Длина 67 нм

à

структуры. При этом, при формировании

митотическойхромосомы,ДНКэукариотической

клетки упаковывается в несколько тысяч раз “с

6 íì

такойточностью,чтовкаждомклеточномцикле

H1 = 24000

воспроизводятсяразмерыхромосом,отношения

11 íì

плеч,особенностипродольнойдифференциации,

Глобулярная

подразделениенаэу-игетерохроматин,атакже

сердцевина

полосы, возникающие при дифференциальном

COOH

окрашивании” (Gatti et al., 1983, p. 83).

á

H2N

Гистон H1

Несомненно, что в основе этой точности лежит

+

какой-тоудивительныйпонадежностимеханизм

компактизации.

11.1. Нуклеосомы

Фундаментальная

субъединица

хроматина-нуклеосома-имеетодинитотже

Нуклеосома

тип организации у всех эукариот. Нити

H1 соединяется

нуклеосом находят в ядрах, обработанных

со специфическим

районом

растворами

низкой

ионной

ñèëû.

нуклеосомы

Индивидуальные нуклеосомы получают в

COOH

результате переваривания хроматина

H2N

микрококковой нуклеазой - эндонуклеазой,

разрезающейнитьДНКмеждунуклеосомами.

Каждая нуклеосома содержит примерно 200

п.н. ДНК, связанной с октамерной частицей,

состоящей из белков-гистонов - по две копии

Нуклеосомы

Н2А, Н2В, Н3 и Н4. Это сердцевинные

соединяются

посредством

(коровые) гистоны. Молекула гистона Н1

гистона H1

являетсямономером,онарасположенаснаружи

COOH

COOH

нуклеосомы, т.к. ее удаление не влияет на

H2N

H2N

структуручастицы(Рис.11.1).

Нуклеосома имеет форму цилиндра,

вокругкоторогоДНКделаетдваоборота(Рис.

11.2).

Участок

ÄÍÊ

между

двумя

Структура нуклеосомы (a) и взаимодействие

нуклеосомами называется линкером. Нить

гистона H1 и нуклеосом. а - Из: Lewin, 1994,

ДНК длиной 146 п.н. обматывается вокруг

p. 800; á - Èç: Alberts et al., 1994, p. 346.

октамера, еще около 50 п.н. приходится на

Когдаизучаютультраструктурухроматина

линкер.

Более90%ДНКвклеткеприсутствуетв

под электронным микроскопом, обычно

составе нуклеосом. После упаковки ДНК в

находятдватипануклеопротеиновыхнитей:10

нуклеосомныеструктурыонаукорачиваетсяв

нм и 30 нм в диаметре. Первая представляет

6ðàç.

собойнитьизнуклеосом,расположенныхдруг

Упаковка ДНК в хромосомах

Глава 11

Рисунок 11.2

Дополнение 11.1

получаются мономерные фрагменты. Если

теперь изолировать ДНК и обработать

рестриктазой,котораяимеетединственныйсайт

рестрикциивэтоммономерномфрагменте,то

Схема расположения ДНК на белковой

получатсядвафрагментаДНК,каждыйсвоего

глобуле (коре) (Из: Lewin, 1994, p. 804).

размера.

Продукты

этого

двойного

Рисунок 11.3

переваривания разделяют в геле с помощью

электрофореза. Затем, используя зонд,

27A

представляющийпоследовательностьпоодну

сторону от сайта рестрикции, выявляют

соответствующий фрагмент. Если

íà

фореграмме выявляется один фрагмент, то

110A

нуклеосомы фазированы. Если получается

мазок, то фазирования нет

(Ðèñ. 11.4).

Результаты,полученныевтакихэкспериментах,

неподдаютсяоднозначнойинтерпретации.

Не совсем ясно, сохраняется ли

нуклеосомная укладка, когда ген начинает

транскрибироваться.Внеделящемся ядре, где

активно работает ряд генов, нуклеосомы

расположены

достаточно

строго

â

определенныхточкахвпромоторнойобласти.

57A

Присутствие нуклеосом вместо факторов

Структура нити хроматина диаметром 30 нм

транскрипциивобластипромотораподавляет

(Èç: Lewin, 1994, p. 812).

активность генов. Белки нуклеосом - гистоны

задругом.Нитьдиаметром30нмпредставляет

конкурируют с факторами транскрипции за

собойспираль,свернутуюизнитидиаметром

участки свободной от белков ДНК. Такие

10 нм. В каждом витке спирали находятся 6

участки могут образовываться в клетке сразу

нуклеосом (Рис. 11.3).

послерепликацииДНК.Еслигистоныуспеют

Вфибрилледиаметром30нмкоэффициент

образовать нуклеосомные структуры в

упаковкиДНКсоставляетпримерно36-40,т.е.

условиях, когда концентрация факторов

каждый микрометр вдоль оси этой нити

транскрипциинедостаточна,тогеноказывается

содержит40мкмДНК.

неактивным(репрессированным).Наоборот,при

Всистемеinvitroнуклеосомысобираются

достаточной концентрации факторов они

независимооттого,какиепоследовательности

успешноконкурируютсгистонамиивобласти

ДНКприсутствуют.

промотораобразуютспецифичнуюструктуру,

Не совсем ясным остается вопрос о том,

прилегаякРНК-полимеразе.

всегдалиспецифическиепоследовательности

В то же время гистоны не сходят

ДНК находятся в определенных позициях в

полностью с ДНК даже в активно

нуклеосоме

(феномен,

называемый

транкрибируемомхроматине.

фазированиемнуклеосом).

В некоторых генах, например, в блоках

Ставилиследующийопыт:еслирасщепить

генов рибосомной 18 и 28S РНК,

нитьснуклеосомамимикрококковойнуклеазой,

нуклеосомная укладка исчезает полностью.

Глава 11

Упаковка ДНК в хромосомах

Рисунок 11.4

чувствительностью к разным

Последовательность-мишень

нуклеазам (Рис. 11.5).

расположена в определенном

Гиперчувствительныесайты,

участке нуклеосомы

связанные с транскрипцией, могут

образовываться под влиянием

факторовтранскрипции.

Можно выделить два типа

генов

ïî

организации

èõ

Мономеры ДНК образуются

промоторов: предустановленные

после обработки

(preset) и реконструирующиеся

микрококковой нуклеазой

(remodeling)

(Ðèñ.

11.6).

Предустановленные гены - это

такие,вкоторыхпромоторныесайты

связывания транс-действующих

Последовательность-мишень

факторов доступны этим факторам

(ò.å.

îíè

находятся

â

разрезается рестриктазой

ненуклеосомном

состоянии,

гиперчувствительном к ДНКазе I)

ещедоначалаактивациигена.Входе

активирования гена регулирующие

Фрагмент ДНК имеет сайт

факторы связываются с цис-

рестрикции в определенном

действующими регуляторными

положении. В результате

элементами и запускают процесс

электрофореза образуется

транскрипции

áåç

заметных

одна полоса

изменений

â

хроматиновой

структуре промоторного района.

Напротив, в реконструирующихся

Схема эксперимента для установления наличия

генах некторые из необходимыхдля

фазирования нуклеосом (Из: Lewin, 1994, p. 820).

активирования цис-действующих

Изменения структуры хроматина

регуляторных элементов упакованы

в нуклеосомы и поэтому недоступны.

улавливаютсяпослеобработкиоченьнизкими

Нуклеосомы должны переформироваться в

концентрациями ДНКазы I. После такой

ответ на активирующий сигнал, чтобы цис-

обработки образуются разрывы в участках,

элементысталибыдоступными.Врезультате

называемыхгиперчувствительнымикДНКазе

должны

появиться

участки,

I. В этих сайтах ДНК не организована в

гиперчувствительные к ДНК-азе. Ген hsp26

нуклеосомныеструктуры.Каждыйгенимеет

-

является

хорошим

примером

1-2 участка, чувствительных к ДНКазе I,

индуцируемого предустановленного гена

расположенных чуть выше зоны промотора.

(Рис. 11.6А). Он индуцируется в течение

В некоторых случаях промоторный

нескольких минут после начала теплового

участок

обладает

повышенной

Рисунок 11.5

Микрококковая

ДНКазаI

MspI ДНКазаI

ген β -глобина

нуклеаза

MspI

-300

-250

-200

-150

-100

-50

Упаковка ДНК в хромосомах

Глава 11

Рисунок 11.6

GAGA-факторомвсистемеinvitro

+1

и выявляются на футпринтах in

À

hsp26

vivo. РНК-полимераза II занимает

HSE

HSE

TATA

участок

äî

+25

è

äàæå

RNA Pol II

GAGA

GAGA

транскрибирует

короткую

+1

молекулу РНК. Однако после

этого РНК-полимераза делает

RNA Pol II

паузу. После индукции гена

+1

тепловым шоком белок HSF

hsp70

TATA

связывается с элементом HSE и

GAGA

GAGA

РНК-полимераза II двигается с

RNA Pol II

HSE

HSE

HSE

HSE

участка паузы. Каких-либо

+1

изменений в структуре хроматина

RNA Pol II

промотора

íå

происходит.

Похожим образом организован

Á

MMTV LTR

+1

ãåí hsp70 (Ðèñ. 11.6À).

У функционирующего в

NF1

клетках млекопитающих гена

GREs TATA

MMTV LTR впромоторномрайоне

находится 6 нуклеосом (Рис.

+1

RNA Pol II

11.6Á.).

Â

õîäå

индукции

нуклеосома, расположенная в

участке, с которым связываются

PHO5

+1

индуцирующиефакторыGRиNF1,

PHO4

TATA

изменяется,

îí

становится

PHO2 PHO4

гиперчувствительнымкДНКазеI,и

+1

белок NF1 начинает связываться с

RNA Pol II

регуляторным участком.

У дрожжей промоторный

Структура промотора и нуклеосомная укладка (Из: Wallrath

район гена PHO5 упакован в 6

et al., 1994) А - предустановленный и Б -

нуклеосом. В зоне образования

реконструирующийся гены. hsp26 и hsp70 - гены белков

второй нуклеосомы от участка

теплового

шока, PHO5 и MMTV LTR гены дрожжей и

началатранскрипции,расположен

млекопитающих,

соответсвенно. Зеленые круги

сайтсвязываниярегулятораPHO4.

представляют собой постоянные нуклеосомы. Круги с

Есть слабый участок связывания

косой штриховкой - нуклеосомы, расположенные ниже

с PHO4 между второй и третьей

точки начала транскрипции. Желтые круги -

нуклеосомой. В присутствии

переформирующиеся нуклеосомы в регуляторной области

фосфата происходит активация

генов. Цис - действующие регуляторные элементы

гена, во время которой 4

изображены прямоугольниками и кружками. Участки,

нуклеосомы реконструируются

связавшие транс-активаторы, изображены черным.

(ñì. Ðèñ. 11.6Á.).

шока. До индукции в регуляторном участке

ãåíà

находятся

äâà

участка,

Литература к разделу 11.1.

гиперчувствительных к ДНКазе-I. Они

Alberts B., Bray D., Lewis J., Raff M., Roberts K.,

локализованы в двух районах HSE. Рядом с

Watson J.D. Molecular biology of the cell

ними расположены тракты из C и T остатков

(Third edition) Garland Publishing Inc. New

(GAGA

район),

непосредственно

York, London, 346, 1994.

примыкающих к HSE. Они связываются с

Глава 11

Упаковка ДНК в хромосомах

Gatti M., Smith D.A., Baker B.S. A gene controlling

сближенных нуклеомеров и образует

30-

condensation of heterochromatin in Drosophila

нанометровуюфибриллуДНП.Третийуровень

melanogaster.Science 221: 83-85,1983.

- хромомерный: петли фибрилл ДНП,

Lewin B. Genes V. Oxford, New York, Tokyo; Oxford

объедин¸нные скрепками из негистоновых

UniversityPress,797-831,1994.

белков, образуют компактные тела (0,1 - 0,2

Russell, P.J. Genetics Fifth edition. Addison Wesley

ìêì),

которые

ïðè

искусственной

Longman, Ins, Menlo Park, California, 330-

деконденсациидадутрозетковидныеструктуры.

331, 1998.

Расположениепетлевыхдоменов,хромомеров,

WallrathL.L.,LuQ.,GranokH.,ElginS.C.R.Architectural

variationsofinducibleeukarioticpromoters:present

может быть неравномерным: участки тела

andremodelingchromatinstructures.BioEssays16:

митотическойхромосомы,обогащенныеими,

165-170, 1994.

могут

соответствовать

полосам

ïðè

WolffeA.P.,PrussD.Deviantnucleosomes:thefunctional

дифференциальной окраске хромосомы.

specializationofchromatin.TrendsinGenetics12:

Четв¸ртый уровень - хромонемный:

58-62, 1996.

сближенные в линейном порядке хромомеры

11.2. Наднуклеосомная укладка

образуюттолстые(0.1-0.2мкм)нити,которые

можноуженаблюдатьивсветовоммикроскопе.

ÄÍÊ

Характерупаковкиэтойнитивтелехроматиды

Табл.11.1даетпредставленияотом,как

ещ¸ недостаточно

выяснен: возможна

упакованаДНКвразличныхядерныхструктурах.

спиральная укладка хромонемы, но не

По-видимому, процесс компактизации

исключено образование ею и ещ¸ одного

ДНК,приводящийвконцеконцовкпостроению

уровня петлевых структур. Конечно, такая

плотного тела митотической хромосомы,

общая схема организации митотических

проходитчерезнесколькоструктурныхуровней

хромосомоченьнеполноотражаетособенности

(Рис.11.7а, б).Первыйуровень-нуклеосомный

строенияихспециализированныхучастков,таких

- обеспечивает сверхскручивание ДНК по

как ядрышковый организатор, теломеры и

поверхностигистоновойсердцевины.Второй-

центомеры.

нуклеомерный (сверхбусина), где ид¸т

В заключение этого обзора можно

объединение6 нуклеосомвглобулу.Таккаквсе

прийти к выводу, что при изучении

эти уровни компактизации происходят на

ультраструктуры хромосом исследователи

огромных линейных молекулах ДНК, то ряд

сталкиваютсяспарадоксальнойситуацией:чем

Таблица 11.1

Укладка ДНК, содержащейся в геноме дрозофилы, в различных ядерных структурах (Из:

Жимулев, 1992, стр. 235).

Коэффициент упаковки

Структура

Длина (мкм)

по отношению

исходной

к предыдущему

молекулы ДНК

уровню

ДНК в геноме

35-56000

-

-

Нуклеосома (нить

-

5-7

5-7

диаметром 10 нм)

Нуклеомер (нить

-

5-7

25-49

диаметром 25-30 нм)

Политенные хромосомы

765-1150

1.2-1.5

30-73

(эухроматиновая часть)

Метафазная хромосома

7.5

90-210

6300

Упаковка ДНК в хромосомах

Глава 11

ближе мы подходим к высшим структурным

скаффолдом, называются SAR (scaffold

уровняморганизациимитотическиххромосом,

attachment regions). На Рис. 11.9 показана

тем меньшей по объ¸му и более низкой по

схема образования петель, основания

над¸жности становится информация об этой

которых погружены в скаффолд из

важнейшейклеточнойструктуре.Б о л ь ш и м

негистоновых белков.

шагом

в моделировании структуры

В интерфазном ядре такие петли

метафазной хромосомы оказалось изучение

связаны с нитчато-сетчатым белковым

структуры хроматина после удаления

образованием, расположенным внутри

гистонов из хромосом обработкой 2M NACl.

ядерной оболочки и называемым ядерным

В таких случаях удаляются все гистоны и

матриксом. Для выделения фрагментов

большая часть негистоновых белков. После

ДНК, к которым прикрепляются белки

этой обработки на месте метафазной

матрикса (их называют MAR-matrix

хромосомы остается остов (scaffold) из

attachment regions), используют следующие

негистоновых белков, из которого выходят

процедуры:

и распределяются в виде гало петлеобразные

1. выделяют клеточные ядра.

нити ДНК длиной 10-30 нм (Рис. 11.8).

2.экстрагируютгистоны.

Центральный скаффолд сохраняет

3.ЗатемдеградируютДНКрестриктазамиили

очертания метафазной хромосомы, даже

ДНКазой.

после

полного переваривания ДНК

4. Из оставшихся ДНК-белковых комплексов

нуклеазами.Петли,выходящиеизскаффолда,

выделяютДНКианализируют.

часто называют “петлевыми доменами”.

Если обработать ДНКазой препараты

Одна из хромосом средних размеров у

хромосом с петлями, то можно получить

человека имеет около 2000 петлевых

белковые остовы и анализировать их состав.

доменов. Участки ДНК, связанные со

Оказалось, что в них присутствует около 20

Рисунок 11.7

à

á

Двойная

2 íì

спираль

ÄÍÊ

Метафазная

1400 íì

хромосома

Глава 11

Упаковка ДНК в хромосомах

Упаковка ДНК в хромосомах

Глава 11

Ïîðà

Внутренняя мембрана

Ламина

Ламина

Нуклеоплазма

Глава 11

Упаковка ДНК в хромосомах

мембранными пузырьками, из которых

Рисунок 11.11

восстанавливается ядерная оболочка.

Основным компонентом ядерной

ламины, являются белки, называемые

ламинами. Эти белки в некоторых случаях

специфично связываются с хроматином, а

также с SAR и MAR-ДНК.

11.3. Хромомерная организация

хромосом

à á â

В конце 19-го века ряд исследователей

Хромомерный рисунок одной из хромосом

(E.G. Balbiani, W. Pfitzner, W. Flemming) (ñì.

Agapanthus umbellatus в пахитене мейоза (а),

Вильсон,1936)нашли,чтохромосомнаянить

средней профазе II (б) и средне-поздней

профазе митоза (в) (Из: Lima-de-Faria, 1954,

на стадии профазы митоза содержит ряд

1975, в кн. Жимул¸в, 1994, стр. 13).

небольшихсильноокрашивающихсятелец,или

определенныйрисунок,строгофиксированный

хромомеров, различающихся по размерам и

форме.Впрофаземейозарисунокхромомеров

наследственно.

в гомологичных хромосомах полностью

Только в профазе митоза и мейоза

симметричен (Рис. 11.11).

(лептотена и пахитена) хромосомы имеют

“Каждоехроматиновоезернышкоодной

хромомернуюорганизациюувсехэукариот,на

нити имеет двойника в другой и нет хотя бы

другихстадияхклеточногоциклахромомеры

малейшейособенностиоднойнити,котораяне

увидеть трудно. Идеи о том, что хромомеры

повторялась бы в точности у ее спутника”

(или гранулярность хромосомной нити)

(Вильсон, 1936, стр. 799). Различаясь между

существуютивинтерфазныхядрах,вкоторых

собойповеличине,форме,содержаниюДНК

индивидуальные хромосомы не опознаются,

и положению в хромосоме, хромомеры

развивалеще В.Флеминг в 1882 г.

обладают

отчетливо

выраженной

Наиболее выраженные хромомеры

индивидуальностьюипридаютхромосомным

встречаются в политенных хромосомах и

нитямиотдельнымихучасткампостоянныйи

хромосомахтипа“ламповыхклеток”.Х.Бауэр

Упаковка ДНК в хромосомах

Глава 11