Метилювання днк
Субстратом метилювання ДНК є цитозини (метильна група приєднується до п’ятого атому кільця з утворенням 5mC – 5-метилцитозину) у складі динуклеотидів CpG (рис. 27). Узагалі, у 70 – 80 % динуклеотидних контактів CpG обидва цитозини є метильованими в еукаріотичному геномі. Зони, де підтримується деметильований стан CpG (CpG-острівці), часто розташовані в промоторах генів домашнього господарства – таких, що є активними незалежно від спеціалізації клітин.
Патерн тканино-специфічного метилювання ДНК є результатом двох процесів: підтримання метильованого статусу після реплікації та метилювання de novo. Підтримуюча ДНК-метилтрансфераза (DNA methyltransferase, Dnmt) спрацьовує протягом 1 – 2 хвилини після реплікації: дві дочірні молекули ДНК містять батьківській ланцюг ДНК (з 5mС у складі CpG) і синтезований ланцюг, де С не є метильованим. ДНК-метилтрансфераза упізнає такі напівметильовані динуклеотидні контакти й відновлює симетрію щодо метилювання С. За рахунок цього процесу патерн метилювання відтворюється в дочірніх клітинах, що є, поряд з відновленням модифікацій гістонів, одним із важливих механізмів епігенетичного спадкування.
Рис. 27. Динуклеотид CpG у ДНК – субстрат метилювання.
Інші ДНК-метилтрансферази здійснюють метилювання ДНК de novo. Особливо важливим цей процес є на ранніх стадіях ембріонального розвитку, коли ДНК є тотально деметильованою. У процесі диференціації здійснюється масове метилювання ДНК, що визначає специфічне вимикання певних груп генів у спеціалізованих клітинах. Крім того, деметилювання є можливим і в диференційованих клітинах, де Dnmt використовуються для відновлення метильованого статусу.
Отже, метилювання ДНК є ознакою репресованих і гетерохроматинових ділянок. Залучення 5mС до репресії пов’язане з наявністю у складі певних білків особливих структурних модулів – MBD (Methyl Binding Domain), які мають специфічну спорідненість до метильованих динуклеотидів CpG. Білки, що містять MBD, є компонентами різноманітних репресуючих комплексів. Зокрема, такі білки рекрутують до метильованих ділянок хроматину гістондеацетилази. З іншого боку, деацетильований стан гістонових хвостів блокує деметилюючі активності, і навпаки – ацетилювання хвостів може викликати деметилювання ДНК у активних ділянках.
Аналогічно, білки, що містять MBD, рекрутують гістонметилтрансферазу, яка здійснює метилювання Lys9 гістону Н3, що призводить до репресії (рис.25, 26). І навпаки: MeLys9 упізнається білком, що містить хромодомен і рекрутує ДНК-метилтрансферазу.
Хоча MeLys9 та 5mС є загальними маркерами конститутивно репресованих ділянок хроматину, не завжди репресія та додаткова компактизація залежить від НР1 – реалізуються також інші системи, більшість з яких є ще не достатньо вивченими. Прикладом такої системиє інактивація однієї з Х-хромосом у клітинах самок ссавців. У складі Х-хромосоми, яка буде інактивованою (обирається випадково на ранніх стадіях розвитку), спрацьовує ген Xist, що продукує велику некодуючу молекулу РНК. Ці РНК укривають собою хромосому і взаємодіють з деякими білками, серед яких – варіант гістону Н2А macroH2A. Імовірно, macroH2A рекрутує гістонметилтрансферазу (здійснюється метилювання Lys9 гістону Н3) і гістондеацетилазу. Метилювання Lys9, у свою чергу, зумовлює метилювання ДНК (що забезпечує епігенетичну спадковість). Крім того, до Х-хромосоми рекрутуються структурні компактизуючі білки (але не НР1).
РНК-інтерференція
Гетерохроматин утворюється передусім на послідовностях ДНК, що повторюються. Причому має значення не послідовність як така, а саме наявність повторів. Виявляється, що у формуванні та підтриманні гетерохроматинового стану повторів (принаймні в центромерах) важливу роль відіграє процес так званої РНК-інтерференції (RNAi – RNA interference).
Узагалі процес РНК-інтерференції запускається будь-якою дволанцюговою РНК (dsRNA – double stranded RNA). Дволанцюгова РНК стає субстратом для РНК-ази, яка отримала назву дайсер (Dicer) (рис. 28): дайсер розрізає молекулу на дволанцюгові фрагменти довжиною 19 – 21 пари основ (по два нуклеотиди залишаються неспареними на кінцях). Ці фрагменти позначають як siRNA (short interfering RNA), вони можуть бути ампліфіковані РНК-залежною РНК-полімеразою (RdRP – RNA depended RNA Polymerase). Вони зв’язуються з кількома білками, утворюючи комплекс RISC (RNA Induced Silencing Complex).
Один із білків має РНК-геліказну активність і розводить два ланцюги siRNA. Один із ланцюгів здійснює комплементарне спарювання з ділянкою мРНК, що синтезується у процесі транскрипції (вихідна dsRNA має збігатися за послідовністю з кодуючою частиною даного гена), спрямовуючи туди RISC. Один із компонентів комплексу – РНК-аза Slicer – здійснює деградацію транскрипту. Крім того, RISC може індукувати активність RdRP для синтезу комплементарного ланцюга РНК на мРНК (чи її частині) як матриці. Відновлена дволанцюгова РНК буде знов підтримувати інактивацію гена шляхом інтерференції. Отже, хоча транскрипція відбувається, реалізується посттранскрипційне вимкнення гена (PTGS – posttranscriptional gene silencing).
Рис. 28. Посттранскрипційне вимикання гена завдяки РНК-інтерференції.
РНК-інтерференція широко використовується останнім часом як дослідницький інструмент (за схемою на рис. 28): достатньо ввести в клітину синтетичну дволанцюгову РНК, послідовність якої ідентична послідовності певного гена, щоб запустити процес інтерференції, вимкнути ген і, таким чином, з’ясувати його функцію. Процес РНК-інтерференції розглядається також як перспективний метод лікування певних хвороб.
У клітині РНК-інтерференція є однією із систем негативної регуляції експресії генів через використання так званих мікроРНК (miRNA). Активація генів мікроРНК (у геномі людини такі гени, які транскрибуються РНК-полімеразою ІІ, присутні в досить великій кількості, яку остаточно не встановлено) призводить до синтезу молекул РНК, що містять дволанцюгові шпильки. Ці шпильки (довжиною 25 – 35 пар основ) вирізаються нуклеазою і стають субстратом для дайсера. Результуюча дволанцюгова мікроРНК є аналогом siRNA: один з її ланцюгів є комплементарним ділянці мРНК певного білкового гена, молекула мікроРНК зв’язується з білками RISC і спрямовує їх до мРНКмішені.
Результатом взаємодії з мРНК може бути її посттранскрипційна деградація (більш характерно для рослин), зупинка білкового синтезу (що є більш характерним для тварин – у цьому разі взаємодія з мРНК відбувається в цитоплазмі), а також рекрутування до хроматину гістонметилтрансфераз із наступною репресією даного гена. Дещо подібне відбувається і в гетерохроматині.
Рис. 29. РНК-інтерференція як механізм підтримання гетерохроматинового стану послідовностей ДНК, що повторюються.
Участь РНК-інтерференції в підтриманні герехроматинового стану центромер ілюструє рис. 29. При порушенні компактизації на центромерних повторах може відбуватися спонтанна транскрипція в різних напрямках. Оскільки матрицею є повтори, існує висока ймовірність синтезу комплементарних молекул РНК: утвориться дволанцюгова РНК, яка запустить процес інтерференції. Крім деградації транскриптів, інтерференція має інший наслідок: RISC, який опиняється в зоні повторів, рекрутує до хроматину гістонметилтрансферазу, що здійснює метилювання Lys9 гістону Н3. За вже відомою схемою (рис. 25, 26) відбувається зв’язування НР1 і компактизаціягетерохроматину.