Биология / Методические указания к аудиторному занятию на 6 неделе

Методические указания к аудиторному занятию на 6 неделе (5.10-10.10.2009).

Тема. Регуляция биосинтеза белка. Понятие о гомеостазе. Определение вида точечной мутации по изменению последовательности нуклеотидов и-РНК.

Цель занятия. Усвоить основы механизма функционирования генов.

Знать: механизм включения и выключения генов, виды и возможные следствия точечных мутаций, кибернетические основы поддержания гомеостаза.

Уметь: определять вид точечной мутации по изменению последовательности нуклеотидов и-РНК.

Оснащение занятия. Таблицы, схемы, методические указания.

Контрольные вопросы для определения исходного уровня знаний

1. Понятие о структурных генах, генах-операторах и белках репрессорах. Гипотеза Жакоба-Моно.

2. Механизм включения генетической активности (дерепрессия или индукция) генов.

3. Механизм выключения генетической активности (реактивация белков – репрессоров и блокирование генов -операторов).

4. Основные кибернетические понятия в биологии: стационарное состояние системы, детектор, регулятор, эффектор, вход и выход из системы, обратная (отрицательная и положительная) связь. Биологические примеры обратной связи.

5. Замещения, инверсии, вставки, выпадения нуклеотидов. Последствия точечных мутаций для собираемых молекул белка и функций организма.

Тестовый контроль усвоения материала. Выбрать только одну букву, соответствующую правильному (правильному и полному) ответу или верно законченному высказыванию. Ответ "все верно" означает, что все вышеназванные варианты ответов верны.

1. При транскрипции белок-репрессор связан

а – с геном-оператором б – со структурными генами в – с индуктором г – все верно д – все неверно

2. Где расположен ген-оператор?

а – на лизосомах б – на ДНК после структурных генов в – на ДНК перед структурными генами г – на ДНК перед геном-регулятором д – все неверно

3. После трансляции белок-репрессор

а – связывается с геном-оператором б – отрывается от структурных генов в – связывается с индуктором г – отрывается от гена-оператора д – все неверно

4. С чем связаны индукторы при трансляции?

а – с геном-оператором б – со структурными генами в – с белками-репрессорами г – все названное верно д – все неверно

5. Белок-репрессор синтезируется по матрице

а – гена-оператора б – промотора в – гена-регулятора г – р-РНК д – все неверно

6. Где расположены структурные гены?

а – на лизосомах б – на ДНК после гена- оператора в – на ДНК перед геном-оператором г – на ДНК перед геном-регулятором д – все неверно

8. Белок-продукт (фермент) синтезируется по матрице

а – гена-оператора б – промотора в – гена регулятора г – р-РНК д – все неверно

10. Назвать самую тяжелую мутацию

а – вставка 1 нуклеотида б – вставка 3 последовательных нуклеотидов в – выпадение 6 последовательных нуклеотидов г – вставка 6 последовательных нуклеотидов д – все названные мутации одинаково опасны

11. Замена одного нуклеотида в ДНК

а – обязательно приводит к замене 1 аминокислоты при синтезе белка б – может не приводить к нарушению последовательности аминокислот в – ведет к «сдвигу рамки» триплетного кода и сборке бесполезного белка г – все верно д – все неверно

12. Указать правильную последовательность событий при биосинтезе белка

а – дерепрессия (Д), сборка белка (Сб), транскрипция (Т), репрессия гена-оператора (Р) б – ДРТСб в – ДТСбР г – СбРТД д – ТСбРД

13. Что такое индуктор?

а – ген-оператор б – промотор в – ген-регулятор г – р-РНК д – все неверно

14. Пример отрицательной обратной связи

а – повышение давления при раздражении барорецепторов б – усиление окисления глюкозы на митохондриях при недостатке кислорода в – задержка жидкости в организме после кровопотери г – все верно д – все неверно

Основная литература:

1. Чебышев Н.В. и др., Биология (Учебник). –М.:ВУНМЦ 2000. С. 229-236.

2. Конспект лекции № 5.

Конспект лекции № 5.

Регуляция активности генов (биосинтеза белка).

Многоклеточный организм человека возникает при слиянии сперматозоида и яйца в единственную клетку – зиготу, содержащую 46 хромосом. Затем из зиготы, путем митотического деления, вырастает полноценный организм из огромного числа разнообразных клеток. В ядре каждой их этих десятков триллионов клеток есть все те же 46 хромосом (46 молекул нуклеопротеидов). При этом последовательность нуклеотидов в ДНК ядра зиготы и ДНК ядра любой клетки (печени, кожи, мозга) одинаковы. Но тогда возникает вопрос, почему клетки нашего организма не похожи друг на друга и почему они выполняют разные функции.

Серьезный шаг по решению этой проблемы был сделан Жакобом и Моно. Они выдвинули гипотезу о том, что у бактерий гены (участки молекулы ДНК, несущие элементарную функционально значимую информацию) работают в клетке не одновременно. Большую часть времени большая часть генов выключена "отдыхает", небольшая часть генов включена "работает". Главный механизм включения и выключения генов Жакоб и Моно связали с понятием о генах-операторах, белках репрессорах и индукторах.

По гипотезе Жакоба-Моно, перед обычным структурным геном находится ген-оператор, обеспечивающий фиксацию фермента РНК-полимеразы (участок для непосредственного присоединения РНК полимеразы называется промотор) и начало транскрипции. Обычно, с геном-оператором связан белок-репрессор и в таком состоянии фермент РНК-полимераза не может связаться с геном оператором и начать считывать информацию структурных генов ДНК (рис. 1).

Рисунок 1. Выключенное (исходное) состояние структурных генов.

ген-оператор структурные гены

───────────────|───────────────────────

───┬═══════════|───────────────────────

└───────────┘ - белок-репрессор

│ │ │

╚════════╩═╝ - РНК-полимераза

Чтобы начать процесс считывания информации (транскрипцию), надо освободить ген-оператор от белка-репрессора. Роль "освободителя" берет на себя молекула-индуктор (дерепрессор). Индуктор связывается с белком-репрессором и отрывает его от гена-оператора (рис. 2 а и 2 б).

Рисунок 2 а. Связывание индуктора с белком-репрессором.

ген-оператор структурные гены

───────────────|───────────────────────

───┬═══════════|───────────────────────

╞═══════════╡ - белок-репрессор

└───────────┘ - индуктор

│ │ │

╚════════╩═╝ - РНК-полимераза

Рисунок 2 б. Освобождение гена-оператора от белка-репрессора (дерепрессия).

ген-оператор структурные гены

───────────────|───────────────────────

───────────────|───────────────────────

┌───────────┐ - белок-репрессор

╞═══════════╡

└───────────┘ - индуктор

│ │ │

╚════════╩═╝ - РНК-полимераза

Теперь ген-оператор свободен и к нему прикрепляется фермент РНК-полимераза, начиная транскрипцию – синтез м-РНК. Структурные гены включаются и начинается транскрипция и трансляция (рис. 3).

Рисунок 3. Структурные гены включены, идет биосинтез белка.

ген-оператор структурные гены

───────────────|──────────────────────

─────┬────────┬|┬─────────────────────

╚════════╩═╝~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ - м-РНК (транскрипция)

РНК-полимераза

~~~~~~~~~~~~~~~~ - и-РНК (процессинг)

┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┐ - белок-продукт

┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┘ (трансляция)

При накоплении достаточного количества белка-продукта происходит реакция его взаимодействия с комплексом индуктор – белок-репрессор. При этом молекулы индуктора разрушаются. Белок-репрессор освобождается (рис. 4).

Рисунок 4. Разрушение молекулы индуктора и освобождение белка-репрессора.

белок-репрессор

┌───────────┐

╞═══════════╡  ┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┐ - белок-продукт

└───────────┘ ┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┘

индуктор

белок-репрессор

┌───────────┐

└───────────┘ ┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┐ - белок-продукт-терминатор индуктора

┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┘

┌──┐┌───────┐

└──┘└───────┘ -распад индуктора

В заключении освобожденный белок-репрессор вытесняет РНК-полимеразу со своего "законного" места и закрывает подход к структурным генам. Тем самым, процесс биосинтеза белка прекращается – структурные гены выключаются – переходят в исходное состояние (рис. 5).

Рисунок 5. Выключенное (исходное) состояние структурных генов

ген-оператор структурные гены

───────────────|───────────────────────

───┬═══════════|───────────────────────

└───────────┘ - белок-репрессор

│ │ │

╚════════╩═╝ - РНК-полимераза

Гипотеза Жакоба-Моно была обоснована результатами исследования культуры кишечной палочки, жившей на питательной среде с глюкозой. При пересадке ее на питательную среду с лактозой скорость роста колонии снижалась, но затем восстанавливалась после включения гена, ответственного за синтез ферментов расщепляющих лактозу. В этом случае, индуктором была сама лактоза, а реактиватором белка-репрессора был белок-продукт (фермент для расщепления лактозы).

У более сложных эукариотов и многоклеточных организмов включение и выключение генов может опосредоваться несколькими промежуточными веществами и медиаторами нервной системы. Тем не менее, общая схема регуляции активности генов остается подобной той, что описана у Жакоба и Моно.

Дальнейшие исследования по клонированию лягушки (Гёрдон) и млекопитающих, доказали определяющее значение белков-репрессоров и индукторов в индивидуальном развитии особей.

Открытие системы белков-репрессоров, контролирующих большую часть структурных генов, и принципиальная возможность их дерепрессии открывает перед медицинской генетикой фантастические перспективы. Если научиться избирательно включать и выключать определенные гены, то можно, например, восстанавливать у больных людей любые органы и даже ампутированные конечности.

Понятие о гомеостазе. Кибернетические основы поддержания гомеостаза.

Живые организмы подчиняются общим закономерностям кибернетики (науки об управлении), открытым Норбертом Винером (1948).

Стационарное состояние любой живой системы создает оптимальные условия для выживания в изменяющихся условиях среды обитания.

Гомеостаз – это постоянство внутренней среды организма.

Адаптация (приспособление) – это система механизмов, поддерживающих гомеостаз.

Классическая схема кибернетической регуляции живой системы состоит из 4 главных элементов (рис. 6): 1-входа, 2-модулятора, 3-выхода 4-обратной связи (отрицательной или положительной).

Рисунок 6. Элементы кибернетической системы.

МОДУЛЯТОР

┌────────────────────────────────────────┐

ВХОД ──│ детектор + регулятор + эффектор │── ВЫХОД

└────────────────────────────────────────┘

ОБРАТНАЯ СВЯЗЬ │

─────────────────────────────────────────────

Модулятор – центральное звено кибернетической системы состоит из 3 частей.

Детектор - устройство контроля состояния системы (осморецепторы раздражаются ионами Na⁺).

Регулятор - устройство для анализа информации и выработки ответа на сигнал от детектора (гипоталамус раздражается и выделяет антидиуретический гормон – АДГ).

Эффектор – устройство обеспечения ответной реакции (почки под воздействием АДГ увеличивают обратную реабсорбцию воды).

Вход – это внешнее воздействие – раздражение, которое приводит к отклонению параметра системы (организма) от стационарного состояния (после употребления соленой пищи растет концентрация натрия в крови).

Выход – это результат реагирования модулятора системы на отклонении ее параметра от стационарного состояния (появление чувства жажды и утоление его водой).

Обратная связь – влияние выхода на вход (увеличение воды в организме снижает влияет на концентрацию соли в крови).

Обратная связь может быть отрицательной (не значит, что плохой) и положительной (не значит, что хорошей).

Отрицательная обратная связь препятствует отклонению системы от стационарного состояния, уменьшая ("-") отклонение по модулю. Ее результат: восстановлен исходный уровень параметра.

Так, для нормальной работы организма необходимо поддерживать концентрацию глюкозы в крови на уровне около 4 мМоль/л (3,6 - 5,5) - это исходный уровень – стационарное состояние. Повышение или снижение концентрации глюкозы называют отклонением от исходного уровня параметра гомеостаза. После этого, в живом организме включаются механизмы, которые могут вернуть концентрацию глюкозы к исходному значению.

Например, если человек съел сладкое или мучное, то уровень глюкозы в крови повышается. Включается парасимпатическая нервная система и вырабатывается гормон инсулин, который переводит глюкозу из крови в клетки (снижение концентрации глюкозы в крови).

Наоборот, когда при физической нагрузке (затрата энергии и уменьшение концентрации глюкозы в крови) включается симпатическая нервная система, в ответ вырабатывается адреналин и переводит глюкозу из депо (гликоген в печени) в кровь (концентрация глюкозы в крови повышается).

В обоих случаях система возвращается в исходное стационарное состояние.

В этих примерах произошло поддержание гомеостаза по принципу отрицательной обратной связи. Уменьшается отклонение от нормы по модулю. Т.о., если ответ организма уменьшает « - » отклонение от стационарного состояния, то обратная связь отрицательная.

Если ответ организма увеличивает « + » отклонение от стационарного состояния, то обратная связь положительная.

Например, при больном сердце уменьшается кровоток во всех органах, в том числе, через почки. Снижение почечного кровотока раздражает юкста-гломерулярные клетки почек, которые вырабатывают гормон ренин. Ренин запускает систему, которая задерживает в организме воду и суживает артерии. При этом нагрузка на сердце возрастает, и оно еще хуже выбрасывает кровь. Но, чем слабее работает сердце, тем меньше кровоток через почки и они выбрасывают еще больше ренина, а чем больше ренина, тем труднее сердцу. Формируется порочный круг болезни. В результате, при отсутствии лечения больной умирает от сердечно-сосудистой недостаточности.

Чаще всего в медицине рассматривают возникновение положительной обратной связи, как «плохое» явление, ведущее к катастрофическим для организма последствиям, а регуляцию с помощью отрицательной обратной связи как «хорошее» физиологическое явление.

Однако возникновение положительной обратной связи не всегда приводит к плохим последствиям. Считается, что потенциал действия в нервных и мышечных клетках является нормальным процессом, который запускается по механизму положительной обратной связи. Небольшая частичная деполяризация мембраны может включить механизм перезарядки мембраны – основу нормальных электрофизиологических процессов организма.

Отрицательная обратная связь тоже не всегда «хорошая». Так, у здорового человека в головном мозге постоянно вырабатываются эндорфины – вещества, обеспечивающие определенный порог болевой чувствительности. Поэтому мы не чувствуем боли при движении суставов, органов пищеварения при перистальтике. При серьёзных повреждениях организма собственных эндорфинов не хватает и для снятия боли вводят наркотические анальгетики (морфин, омнопон, промедол). Но, они не только снимают боль. По механизму отрицательной обратной связи происходит снижение выработки собственных анальгетиков – эндорфинов. Длительный прием наркотиков делает мозг «ленивым» и он «забывает», как делать эндорфины. Внезапная отмена наркотика, ставит больного в беззащитное состояние - он уже не может терпеть обычные нервные сигналы от рецепторов организма. Простые раздражения вызывают боль – наступает «ломка» - абстинентный синдром. Организм попадает в лекарственную зависимость от наркотика.

Фармакологические принципы регуляции больных организмов основаны на знании кибернетических механизмов их физиологической регуляции. Эти принципы включают применение средств действующих на рецепторы (адреномиметики, холиномиметики, адреноблокаторы, холинолитики), транспорт ионов через мембраны (блокаторы кальциевых каналов), концентрацию гормонов (глюкокортикоиды) и т. п.

Лабораторная работа на аудиторном занятии на 6 неделе (5.10-10.10.2009).

Методические указания для самоподготовки к занятию на 6 неделе (5.10-10.10.2009).

Тема. Регуляция активности генов.

Цель самоподготовки. Расширить и закрепить представления по вопросам темы.

Вопросы для самостоятельного изучения задания.

1. Отличия понятий "Ген" и "Цистрон".

2. "Экзоны" и "Интроны".

3. Спейсерные участки ДНК и их функции.

4. Промоторы, операторы, аттенюаторы, энхансеры, белки – репрессоры, транскрипционные факторы и их роль в регуляции активности генов прокариот и эукариот.

5. Терминаторы транскрипции.

Блок дополнительной информации.

Информация о структуре белков и РНК записана в участках ДНК, называемых генами и цистронами.

Ген - это участок ДНК, кодирующий один белок.

Цистрон же - участок ДНК, кодирующий одну полипептидную цепь.

Таким образом, если белок состоит из нескольких разных полипептидных цепей (субъединиц), то его ген включает несколько цистронов (рис. 1).

Рис. 1. Ген и цистрон

Однако такое подразделение относится, в основном, к бактериям, где цистроны одного гена обычно следуют на ДНК друг за другом.

У животных же и человека цистроны нередко располагаются в разных хромосомах и обычно тоже называются генами: например, ген альфа-цепи и ген бета-цепи гемоглобина.

Кроме генов всех белков организма, в хромосомах имеются также гены РНК. Среди них четыре вида генов для рибосомных РНК и нескольких десятков генов для транспортных РНК.

Общая совокупность генов, определяющих наследственную информацию организма, называется геномом.

Всего в геноме бактерий (конкретно - кишечной палочки) - около 2500 цистронов. В хромосомах человека число генов около 30 000.

Почти все гены эукариот (в отличие от генов прокариот) имеют характерную особенность: содержат не только кодирующие участки - экзоны, но и некодирующие - интроны (рис. 2.). Экзоны и интроны перемежаются друг с другом, что придает гену как бы «разорванную» структуру.

Рис. 2. Экзоны и интроны.

Число интронов в гене варьирует от 2 до нескольких десятков; в гене миозина их около 50. Порой на интроны приходится до 90 % общей длины гена.

Между генами также находятся некодирующие последовательности - спейсеры. Несмотря на общее название, функциональная роль их может быть различной.

Многие спейсерные участки, видимо, выполняют структурную роль: - участвуют в правильной укладке нуклеосомной цепи в высшие структуры хроматина, в прикреплении хромосом к аппарату центриолей и т. д. Другие спейсеры являются специфическими местами (локусами) связывания определенных белков функционирующих на ДНК (ДНК-полимеразного комплекса и белков, выполняющих регуляторную функцию).

При этом участки связывания РНК-полимеразы (фермента, синтезирующего РНК на ДНК) называются промоторами. Они либо вплотную примыкают к началу гена (или группы генов), либо отделены от гена какими-либо другими функциональными локусами.

Характерный компонент промоторов у кишечной палочки - т. н. бокс (последовательность) Прибнова:

(5')-ТАТААТ-(3')

(3')-АТАТТА-(5').

Он находится за 15 нуклеотидных пар (н. п.) от стартовой точки транскрипции. Общая же протяженность промотора - несколько десятков н. п.

В случае эукариот промотор - более сложное понятие, поскольку РНК-полимераза связывается с ДНК не непосредственно, а лишь вместе с комплексом других белков - т. н. общих факторов транскрипции.

В промоторе эукариот различают небольшую область инициации, ТАТА-бокс (сходный с боксом Прибнова у бактерий) и ряд других типичных участков.

Что касается участков связывания регуляторных белков, то у бактерий их называют операторами. Они располагаются после промотора (рис. 3). При определенных условиях с оператором связывается специфический белок-репрессор, и это блокирует «прочтение» РНК-полимеразой соответствующей группы генов. Еще одним регулятором работы гена может быть - аттенюатор – это выключатель - участок ДНК между оператором и структурными генами, на котором при определенных условиях прекращается транскрипция.

Рис. 3. Функциональные отделы в ДНК бактерий.

У эукариот (включая человека) регуляцию «прочтения» генов осуществляют не только белки-репрессоры, но и белки-активаторы - транскрипционные факторы (рис. 4).

К последним относятся общие факторы транскрипции, необходимые для связывания РНК-полимеразы с промотором. Эти факторы имеются во всех клетках и необходимы для «прочтения» любого функционирующего гена.

Другие транскрипционные факторы повышают активность только определенных генов. Локусы ДНК, связывающие такие факторы, называются энхансерами.

Энхансеры могут располагаться достаточно далеко от регулируемого гена: на расстоянии нескольких тысяч нуклеотидных пар.

Рис. 4. Функциональные отделы в ДНК эукариот.

Как же связывание с ними транскрипционных факторов может стимулировать активность гена?

Видимо, дело в сложной пространственной организации ДНК. Она образует петли, благодаря чему энхансеры сближаются с промоторной зоной и связанные с ними факторы влияют на активность транскрипционного комплекса.

Причем, для некоторых ключевых генов в клетке имеется сразу несколько энхансеров, достаточно удаленных друг от друга. Следовательно, все они в результате изгибов ДНК должны собираться примерно в одном месте пространства.

Эта ситуация напоминает формирование активного центра в молекуле фермента. Там тоже аминокислотные остатки, образующие этот центр, расположены в разных участках полипептидной цепи и собираются вместе лишь при формировании третичной структуры.

Что же касается белков-репрессоров, то они при вхождении в состав транскрипционных комплексов не повышают, а понижают их активность.

Часто используется также термин «супрессоры» - так называются факторы (обычно это белки), которые угнетают тот или иной клеточный процесс. Например, опухолевые супрессоры - регуляторные белки, препятствующие опухолевому росту. Очевидно, по механизму своего действия они могут быть как репрессорами, так и транскрипционными факторами.

Наконец, в цепи ДНК после структурных генов могут содержаться короткие локусы - терминаторы, служащие сигналами об окончании (терминации) транскрипции ДНК.

Домашнее задание.

1. Нарисовать в тетради для домашних работ схему регуляции активности генов прокариот.

2. Нарисовать в тетради для домашних работ схему регуляции активности генов эукариот.

3. Дать свои определения терминам: интрон, экзон, промотор, оператор, аттенюатор, энхансер, белок – репрессор, транскрипционный фактор, терминатор. При этом обязательно указывать, что это: участок ДНК или белок.

Основная литература:

1. Чебышев Н.В. и др., Биология (Учебник). –М.:ВУНМЦ 2000. С 28-72.

2. Конспект лекции № 5.

Дополнительная литература.

1. Грин Н., Стаут У., Тейлор Д. Биология: В 3-х т. Т.3: Пер с англ. / Под ред. Р. Сопера. – М.: Мир, 1993. С.217-221.

2. Мушкамбаров Н.Н., Кузнецов С.Л. Молекулярная биология. М.: 2003 554 с.