2.2.4.4. Изучение вероятности вертикального пути передачи вгс и вгв.

Одной из важных проблем парентеральных вирусных гепатитов при решении которой целесообразно использование ПЦР является определение частоты передачи инфекционных агентов вертикальным путем.

Перинатальный путь инфицирования является одним из основных путей распространения гепатита В [112, 118]. Частота передачи вируса существенно варьирует - от 8% до 52% [112, 126]. Массовый скрининг на ВГВ беременных является важнейшим условием для предотвращения вертикального пути передачи вируса [286].

Для вируса гепатита С также доказана возможность перинатального пути инфицирования, но в связи со значительно более низкой контагиозностью ВГС роль этого пути инфицирования в его распространении в отличие от гепатита В не столь велика. Риск заражения плода от матерей, больных ВГС варьирует по данным разных авторов от 3,6% до 10,7% [99, 151, 260, 340]. При этом основным фактором риска передачи является наличие вирусной РНК в крови и ее концентрация [154, 359], а также наличие коинфекции вирусом иммунодефицита, увеличивающее вероятность вертикальной передачи ВГС в 3 раза [257]. У матерей больных ВГС, не имевших активной репликации вируса, инфицирование детей как правило, не происходит [151, 260, 283, 340] или его частота была существенно меньше, чем у РНК-позитивных матерей — 1-3% [99]. У 31% детей, получивших ВГС вертикальным путем, на 3 день после рождения выявлялась вирусная РНК [270].

Применение метода ПЦР позволяет получить новую более объективную информацию о вертикальном пути передачи парентеральных вирусных гепатитов. Нами с использованием метода ПЦР проведено изучение особенностей течения вирусного гепатита С у беременных женщин и вероятности передачи инфекционного агента от инфицированных матерей новорожденному.

Было проведено определение частоты активной репликации вирусов гепатитов С и В у 288 беременных с диагнозами «хронический гепатит С» и «хронический гепатит В», и у 828 детей первых лет жизни, рожденных матерями, инфицированными гепатитами С и В.

Данные о частоте выявления РНК гепатита С у беременных женщин, детей первых лет жизни и в группах сравнения представлены в таблице 26.Таблица 26 Выборка пациентов	Частота выявления РНК HCV в %
Беременные (п=288)	41,3±2,9
Дети первого года жизни (п=1225)	10,2±3,0
Дети возраста с 1 до 3 лет (п=255)	19,1±2,4
Дети возраста с 4 до 7 лет (п=183)	29,7±1,6
Взрослые , имеющие суммарные антитела к Cor HCV (n=1280)	54,5±1,4
Взрослые с антителами к NS3, NS4,NS5, антителами классов М, G к Cor. (п=68)	76,5±6,1

У беременных женщин частота выявления РНК вируса гепатита С достоверно ниже меньше, чем в выборках взрослых больных (1 > 2,6) . Это согласуется с данными литературы о низкой активности вирусных гепатитов у беременных. У детей первых лет жизни репликация ВГС определялась также достоверно реже, чем у взрослых (1 > 2,6). В таблице 27 представлены данные о частоте выявления РНК ВГС у детей первого года жизни и у детей в возрасте от 1 года до 7 лет, рожденных инфицированными матерями.

Выявление РНК HCV в различных выборках обследованных.

Таблица. 27

Частота выявления РНК вируса гепатита С у детей разных возрастных групп. Возраст	Количество обследованных детей	Частота выявления РНК HCV в %
1 месяц	89	10,1±3,2
2 месяца	133	9,8±2,6
3 месяца	231	10,0±2,0
4 месяца	147	11,6±2,6

Продолжение таблицы 27
5 месяцев	97	11,3±3,3
6 месяцев	143	10,5±2,6
7 месяцев	118	9,3±2,7
8 месяцев	63	14,3±4,4
9 месяцев	71	16,9±4,4
10 месяцев	58	12,1 ±4,3
11 месяцев	75	24,0±4,9
1 год	102	17,6±3,8
2 года	81	18,5±4,3
3 года	72	18,1±4,5
4 года	50	28,0±6/3
5 лет	54	19,2±5,4
6 лет	44	25,0±6,5
7 лет	35	20,0±6,8

Как следует из представленных результатов, у детей, рожденных женщинами, больными хроническим гепатитом С, РНК ВГС выявляется в 10% случаев в первые месяцы жизни. Это свидетельствует об их внутриутробном инфицировании или инфицировании во время родов. Таким образом, можно считать, что вероятность вертикального пути передачи вируса в Нижегородском регионе составляет не менее 10%.

Следует отметить, что концентрация вирусной РНК у детей, как правило, ниже, чем у взрослых и часто находится на нижней границе чувствительности тест-системы. Полученный показатель инфицированности детей первого года жизни в Нижегородской области в 2 раза выше, чем аналогичный показатель в развитых странах [90]. По- видимому, это связано с тем, что в период проведения исследований (1999-2001 гг.) не имелось возможности предварительного обследования всех беременных женщин на наличие РНК

ВГС и ведения беременных группы риска в соответствии с международными стандартами. Это предположение подтверждается тем, что в группе детей в возрасте до года (п = 104), матери которых в период беременности и до родов находились на диспансерном учете в гепатологическом отделении ГУЗ «Городская инфекционная клиническая больница №2», РНК выявлена только в 4,8±2,1% случаев, что достоверно ниже, чем в общей выборке детей до года, рожденных инфицированными матерями, у которых этот показатель составил 10,2±3,0(1>2,6).

Количество детей с активной репликацией ВГС в возрастном периоде от 1 до 10 месяцев практически не возрастает и составляет 10 - 14%. В группе детей в возрасте от одного года и старше происходит постепенное увеличение частоты выявления вирусной РНК. Возможно, это обусловлено началом действия других путей передачи вируса. Нами выявлены случаи, когда у детей группы риска по ВГС в первые 2-3 года жизни РНК не регистрировалась, а позднее была обнаружена.

Результаты обследования беременных женщин, инфицированных вирусом гепатита В, и рожденных ими детей представлены в таблице 28. Сравнение проводили с выборкой взрослых пациентов - мужчин и небеременных женщин, больных хроническим гепатитом В.

Таблица 28. Выявление ДНК ВГВ в различных выборках обследованных. Выборка	Кол-во	Частота выявления ДНК НВУ в %
Взрослые с диагнозом ХВГВ	765	79,3±1,5
Беременные	42	30,8±7,1
Дети первого года жизни	141	12,8±2,8
Дети в возрасте с 1 до 7 лет	125	23,2±3,8

В результате обследования у 42 беременных женщин, имеющих белковые маркеры ВГВ, вирусная ДНК выявлена в 30,8±7,1% случаев, тогда

как в контрольной выборке этот показатель составил 79,3±1,5%. Для гепатита В также, как и для ВГС отмечается достоверное снижение активности процесса в период беременности (t > 2,6).

Количество обследованных детей первых лет жизни группы риска по ВГВ было не столь велико, как число детей с гепатитом С, поэтому были сформированы только две выборки: дети первого года жизни и дети в возрасте от 1 до 7 лет. В первой выборке (141 человек) частота выявления ДНК вируса гепатита В составила 12,8±2,8%, во второй выборке (125 человека) — 23,2±3,8%. Поскольку у детей, рожденных инфицированными матерями, уже в первый год жизни частота выявления ДНК ВГВ составляет 12,8±2,8%, следовательно, вероятность передачи ВГВ внутриутробно и во время родов составляет не менее 13%.

Полученные результаты свидетельствуют, что у беременных женщин происходит снижение активности репликации вирусов гепатитов В и С. Не смотря на частота передачи ВГС и ВГВ от матери к ребенку в период беременности и при родах достаточно высока, она составила не менее 10,1% для ВГС и не менее 12,8% для ВГВ. Выявление вирусных нуклеиновых кислот в первые месяцы жизни у детей групп риска свидетельствует о необходимости проведения ПЦР-обследования беременных женщин в случае обнаружения у них белковых маркеров вирусных гепатитов в дородовый период, а детей, рожденных ими, - в первый месяц жизни.

2.2.4.5. Оценка эффективности метода минипулов при обследовании доноров.

Обеспечение вирусной безопасности донорской крови и препаратов, производимых из крови, - одна из важнейших проблем практической гематологии. В настоящее время в США и ряде стран Европы законодательно принята проверка донаций крови методом ПЦР минипулов. В Российской Федерации также проводятся работы в данном направлении [67].

Нами проведено изучение возможной чувствительности метода ПЦР минипулов, базирующегося на отечественных тест системах, при

определении контаминации донаций крови РНК ВГС. Для этого были проанализированы результаты всех проведенных нами полуколичественных исследований на РНК ВГС за период 1997 - 2006 гг., в которых нуклеиновая кислота вируса была выявлена (всего 2256 исследований). Результаты представлены в таблице 29.

Таблица 29.

Концентрации ВГС, определенные у больных, обследованных за период 1997 - 2006 г.г. (п=2256)

Концентрация вируса в частицах на мл	Количество больных
	Абс.ч.	%
Не более 103	359	15,9±1,9
Не более 104	562	24,9±1,8
Не менее 105	1335	59,2±1,3
Всего	2256	100

Минимальная концентрация вируса (вирус обнаруживается только в цельной сыворотке или плазме) - 10 частиц в мл отмечалась в 15,9±1,9% случаев; концентрация вируса 10⁴ частиц в мл - в 24,9±1,8% случаев, а концентрация 10⁵ частиц в мл и выше - в 59,2±1,3%. Следовательно, при использовании отечественных ПЦР тест-систем на ВГС, имеющих

о

чувствительность 10 частиц в мл, для пулов из 100 донаций, при наличии в них единичных положительных образцов, эффективность обнаружения контаминированных пулов составит около 60%. При анализе пулов из 10 донаций с 1-2 положительными пробами, эффективность выявления будет не более 85%. Таким образом, вероятность получения ложно-отрицательных результатов достаточно велика, что не позволяет рекомендовать такой вариант ПЦР минипулов для широкого внедрения в практические исследования.

Среди задач настоящего исследования было определение экономической и противоэпидемической целесообразности проведения индивидуального ПЦР-обследования постоянных доноров плазмоферреза Нижегородской областной станции переливания крови. Данные исследования ведутся с 2002 года. Обследовались только те доноры, в крови которых наблюдалось повышение активности ферментов печени - алатдегидрогеназы и асатдегидрогеназы. Всего проанализировали 871 образец крови на наличие ДНК ВГВ и 875 образцов крови на наличие РНК ВГС. РНК ВГС выявлена в 7,5±0,9% случаев. ДНК ВГВ - в 2,8±0,6%.

Полная коммерческая стоимость проведенного ПЦР исследования доноров на ВГС и ВГВ составляет 366640 рублей в ценах 2009 г. Если предположить, что 90 доноров у которых выявлены ВГС и ВГВ инфицируют только по 1 человеку, стоимость базовых препаратов для лечения пострадавших составит от 27000000 до 63000000 рублей в зависимости от выбранного курса лечения. Следовательно, затраты на лечение при минимально возможном инфицировании донорской кровью превысят стоимость ПЦР-исследования в 74 - 172 раза. Полученные результаты свидетельствует об экономической целесообразности данных исследований и их важности для противоэпидемической безопасности в службе крови. 2.2.4.6. Разработка алгоритмов использования ПЦР для обследования больных ВГС и ВГВ

Из данных литературы известно и результатов нашего исследования следует, что существенным звеном алгоритма использования ПЦР в диагностике ВГС является генотипирование вируса, так как терапия заболевания, вызванного вирусом генотипа lb, существенно отличается от лечения гепатитов, обусловленных вирусами других генотипов [90]. В первое время при проведении исследования мы ограничивались «in hause» ПЦР- тестом, который давал информацию о принадлежности или не принадлежности вируса к генотипу lb. В настоящее время используется мультиплексная ПЦР тест-система разработки и производства ФГУН «ЦНИИЭ Роспотребнадзора», позволяющая проводить выявление наиболее распространенных генотипов ВГС 1а, 1Ь, 2а, За. Результаты проводимых исследований позволили получить новую информацию о распространении доминирующих генотипов ВГС в Нижегородском регионе.

Следует отметить, что система для генотипирования ВГС имеет существенный недостаток. Она менее чувствительна, чем тест-система для детекции ВГС. В связи с этим отрицательный результат при генотипировании не всегда свидетельствует о том, что выявленный вирус не относится к генотипам 1а, 1Ь, 2а, За. Для получения объективного результата нами рекомендуется проводить исследование образцов сыворотки или плазмы крови, в которых РНК ВГС выявляется в разведениях в 10-100 раз. Неопределенный результат возможен и при достаточно высоких концентрациях вируса - 10⁴ - 10⁵ вирусных частиц/мл. В таком случае для лечения больного целесообразно проводить терапию, применяемую для ВГС, вызванного генотипом 1Ь.

В результате проведенных исследований нами разработаны следующие алгоритмы использования ПНР в диагностике гепатитов, вызванных РНК- и ДНК-содержащими вирусами.

I. Перед проведением противовирусной терапии ВГС и в ее ходе предлагается следующий алгоритм обследования пациента.

1. Качественное определение вирусной РНК в плазме или сыворотке крови. Препарат к-ДНК, полученный обратной транскрипцией нуклеиновых кислот, выделенных из плазмы или сыворотки, хранится до завершения исследования.

2. При получении положительного результата на этапе 1 проводится определение вирусной нагрузки ПЦР с десятикратными разведениями препарата кДНК (в 10, 100 раз).

3. При выявлении РНК ВГС в разведениях в 10-100 раз осуществляют генотипирование вируса, с на этапе 1.

По истечении месяца с момента начала лечения проводят проверку. При отсутствии снижения концентрации вируса курс лечения следует отменить или провести его изменение. Если лечение протекает успешно, повторные проверки проводятся по назначению врача.

И. Алгоритм ПЦР-обследования на другие РНК-содержащие вирусы гепатитов (BrG, BrD) отличается от алгоритма обследования на ВГС отсутствием стадии генотипирования.

III. Алгоритм обследования больных ВГВ перед проведением лечения исключает этапы обратной транскрипции и генотипирования. Он состоит из 2 стадий:

1. Качественное определение вирусной ДНК в плазме или сыворотке крови. Препарат нуклеиновых кислот, выделенных из плазмы или сыворотки, хранится до завершения исследования.

2. При получении положительного результата на этапе 1 проводят оценку концентрации вируса ПЦР с десятикратными разведениями препарата нуклеиновых кислот (в 10, 100, 1000 раз).

Ход обследования больных в процессе лечения ВГВ аналогичен алгоритму обследования больных ВГС.

При проведении исследования возможно осуществление всех этапов исследования в один прием, в течение одного рабочего дня. Поэтапное исследование занимает 2-3 дня. Этот вариант снижает стоимость исследования. Вероятность отрицательного результата на этапе 1 у больных ХВГС составляет 30-50%, а у больных ВГВ, имеющих HBs-антиген - 20%. При отрицательном результат на этапе 1 исследование заканчивается, что дает экономию реактивов и трудозатрат. На рисунках 26, 27 представлены алгоритмы использования ПЦР в диагностике ВГС и ВГВ.

Проведенные исследования позволили выявить значимые и перспективные направления использования ПЦР в диагностике парентеральных вирусных гепатитов: определение активности размножения вирусов при моноинфекциях и гепатитах смешанной этиологии, изучение

вертикального пути передачи в, генотипирование ВГС, обеспечение инфекционной безопасности донорской службы.

Выделении РНК из плазмы (сыворотки ) крови) 1олучение «ДНК в реакции обратной транскрипции

разведений кДНК (полуколичественный анализ)