ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО НАДЗОРУ В СФЕРЕ ЗАЩИТЫ ПРАВ ПОТРЕБИТЕЛЕЙ И БЛАГОПОЛУЧИЯ ЧЕЛОВЕКА

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ «НИЖЕГОРОДСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭПИДЕМИОЛОГИИ И МИКРОБИОЛОГИИ имени академика

И.Н.БЛОХИНОЙ

На правах рукопис

и

05201051003 Мазепа

Владимир Николаеви

ч

Оптимизация и комплексное использование полимеразной цепной реакции в диагностике актуальных инфекционных заболеваний на модели острых кишечных, хеликобактерной, негонококковых

урогенитальных инфекций и вирусных гепатитов.

03.02.03- микробиология

Диссертация

на соискание ученой степени доктора биологических наук

Научный консультант Профессор, д.м.н. Ефимов Е.И.

Нижний Новгород 201

0ОГЛАВЛЕНИЕ

Актуальность проблемы. 4

.Научная новизна работы. 7

Теоретическое значение работы. 10

Практическое значение работы. 10

Апробация работы. 14

Объем и структура работы. 15

1.2. Современная лабораторная диагностика ряда актуальных бактериальных и вирусных инфекций 1.2.1 Диагностика бактериальных ОКИ. 26

Диагностика Mollicutes— М. hominis, U. urealyticum. 62

2.СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 71

2.1. Материалы и методы 71

GTTTTTAATACTCCTGAACGGCGTTTTTTTTAGATTGGCTCCATTAT 89

TTTTCTTTCTTCCATTTTTAAATAACGGTATAATTTCTCCATCTATTA 89

GAATACCTGTGATTTTTCTTGTTGCATCAGGATTAATTACTTCTGGT 89

AAGGTAGACATAGGTTCTTCTGTTTTTGAACATGTTTATTTCCTTAT 89

GTTCAAGGAAATAATTGTTGGCCTCCTTCTCTCTTTTTGCTTGTCTC 89

TTCCCTTTTGGATATTTCATGCTGTTGGTAGCATTATTGACAACCAG 89

CGTGGGGCAACGCTTAGTAGTTCAATTGATCCTGCCAATGGTGTTG 89

ATACGTCTGAGTTGGCAAAATTTTTCAATCTTTTTTCTGCAGTTGTA 89

TTTCTATACAGTGGTGGTATGGTCTTTATTTTAGAATCCATACAATT 89

GTCTTATAATATATGCCCGTTATTTTCTCAATGTTCTTTCCGTGTCT 89

CAAATATCTTAACATTTCTGACTTTATTGGCAAGTCAGGCTGTTATT 89

TTAGCCAGTCCTGTTATGATAGTATTGTTACTATCAGAAGTATTACT 89

TGGTGTATTATCGAGATTTGCTCCGCAGATGAATGCTTTTTCCGTA 89

TCATTAACTATTAAAAGTTTACTTGCAATATTTATTATTTTCATCTG 89

TTCTTCTACTATTTACTTTTCTAAAGTTCAATTTTTCCTCGGTGAAC 89

ATAAATTTTTCACAAATCTATTTGTTAGATAAAATATTATGGCAAAT AAAACAGAAAAGCCGACACCTAAAA 89

8112 5' - СТААССАТТОССССАСССТССТТСТС-З'; «внутренние»: вЪЗ 5' - ССАСАТТТТСААССТСЖТТС-З'; 91

ЭЬ4 5' - СвССААСААТТАТТТССТТС-З'. 91

ПЦР - детекция возбудителей ОКИ 141

Рис 13 Основные направления использования ПЦР в клинической диагностике и эпиднадзоре ОКИ. 141

1 23456789 10 154

ж: 190

i 249

ВГВ — вирусный гепатит В

ВГС — вирусный гепатит С

В ГО - вирусный гепатит в

ВГБ - вирусный гепатит О

ВКО - внутренний контрольный образец

ВПГ1/П - вирус простого герпеса I и II типов

ВПЧ — вирус папилломы человека

ВПЧ ВКР - вирус папилломы человека высокого канцерогенного риска

ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота

ИФА - иммуно-ферментный анализ

ЛЦР — лигазная цепная реакция

НИФ - непрямая иммуно-флюоресценция

НК - нуклеиновая кислота

НУГИ — негонококковые урогенитальные инфекции

ОАГА — отягощенный акушерско-гинекологический анамнез

ОКЗ — острое кишечное заболевание

ОКИ - острая кишечная инфекция

ОТ - обратная транскрипция

ПИФ - прямая иммуно-флюоресценция

1Тцр — полимеразная цепная реакция

РНК - рибонуклеиновая кислота

ХВГВ — хронический вирусный гепатит В

ХВГС — хронический вирусный гепатит С

ЦМВ — цитомегаловирус

МА8ВА - транскрипционная амплификацияВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы.

На современном этапе для успешного выполнения приоритетных национальных проектов и правительственных программ в сфере здравоохранения, которые традиционно ориентированы на предупреждение распространения и ликвидацию актуальных и социально-значимых инфекционных заболеваний, важное значение приобретает совершенствование методов их лабораторной диагностики.

Актуальной задачей является разработка и внедрение в практическую медицину и систему эпиднадзора технологий, отвечающих следующим требованиям: высокая чувствительность, прецизионная специфичность, информативность, объективность, экспрессность, высокая

производительность, универсальность (выявление различных возбудителей в любом типе клинического материала), биобезопасность для исполнителей, возможность автоматизации процесса. Полимеразная цепная реакция (ПЦР), основанная на выявлении уникальных фрагментов геномов инфекционных агентов, соответствует данным требованиям, существенно расширяет возможности диагностики, позволяет обнаруживать некультивируемые и труднокультивируемые формы микроорганизмов [16,89,161,278,281]. Универсальность метода ДНК-диагностики и автоматизация практически всех этапов анализа позволяют осуществлять одновременное выявление нескольких инфекционных агентов, способных вызывать определенный тип патологии, проводить скрининговые обследования различных контингентов населения в профилактических целях.

Несмотря на обилие публикаций, посвященных методу ПЦР и его использованию в диагностике отдельных нозологических форм, работы содержащие материалы комплексных ПЦР исследований инфекционных заболеваний, обусловленных широким спектром возбудителей, достаточно редки. Данные о частоте выявления возбудителей зачастую противоречивы, а проблемы ПЦР обследования обширных контингентов одновременно на несколько различных инфекционных агентов и определения роли и места молекулярно-биологических методов в общей системе лабораторной диагностики инфекционных заболеваний освещены недостаточно.

Широко распространенные социально значимые инфекционные заболевания, такие как острые кишечные и негонококковые урогенитальные инфекции, хеликобактериозы и вирусные гепатиты приносят значительный вред здоровью жителей России и экономический ущерб [34,35,65,90]. Кроме этого, хеликобактериозы и гепатиты существенно снижают продолжительность жизни, а негонококковые урогенитальные инфекции отрицательно влияют на репродуктивную функцию. Активизация и оптимизация внедрения современных технологий в диагностику этих инфекций способствует своевременному назначению этиотропной терапии, уменьшению продолжительности лечения и количества осложнений.

В связи с вышеизложенным, особую актуальность приобретают вопросы выбора наиболее значимых направлений и объектов исследования, создания и подбора тест-систем для ПЦР-диагностики, их апробации и адаптации к медицинской практике, разработки оптимальных алгоритмов применения как отдельных диагностикумов, так и сочетаний нескольких тест-систем для улучшения технологичности, повышения эффективности и уменьшения стоимости исследований.

Цель работы - оптимизировать и адаптировать собственные (экспериментальные) и коммерческие ПЦР тест-системы к решению задач диагностики острых кишечных инфекций, хеликобактерной инфекции, негонококковых урогенитальных инфекций, вирусных гепатитов; разработать стратегию и тактику использования метода ПЦР для наиболее рационального и эффективного выявления возбудителей этих заболеваний.

Задачи исследования: 1. Провести оптимизацию методов ПЦР-диагностики для выявления актуальных патогенов - возбудителей ОКИ, хеликобактерной инфекции, вирусных гепатитов В и С, НУГИ.

2. Разработать алгоритмы диагностики ОКИ, хеликобактерной инфекции, вирусных гепатитов В и С, НУГИ с использованием оптимизированных нами методов на основе отечественных ПЦР тест-систем.

3. Апробировать и адаптировать к практической диагностике систему молекулярно-биологических методов выявления актуальных бактериальных возбудителей ОКИ - бактерий родов Shigella, Salmonella, Yersinia, Campylobacter и генов, ответственных за патогенность энтеробактерий.

4. Оценить возможности метода ПЦР при изучении распространения бактерий Н. pylori у больных разных возрастных групп с различными типами гастродуоденальной патологии, а также при внутривидовом типировании и выявлении генов факторов патогенности Н pylori.

5. Разработать экономичный вариант метода ПЦР для оценки вирусной нагрузки у больных вирусными гепатитами В и С, изучить особенности репликации вирусов гепатитов В, С, D, G при моно- и смешанном инфицировании, определить эффективность и значимость вертикального пути передачи вирусов гепатитов В и С в Нижегородском регионе.

6. С помощью комплексного ПЦР исследования получить новые знания о распространении и особенностях циркуляции наиболее значимых возбудителей НУГИ (U. urealyticum, М. hominis, С trachomatis, Cytomegalovirus, Herpes simplex MI) у взрослых и детей, и о возможной связи отдельных представителей НУГИ с формированием различных форм патологии.

На основе полученных новых знаний определить роль и место молекулярно-биологических методов в лабораторной диагностике НУГИ, ОКИ, хеликобактерной инфекции, парентеральных вирусных гепатитов, провести апробацию разработанных алгоритмов их диагностики в практической медицине

.Научная новизна работы.

Впервые в Нижегородском регионе проведено освоение и внедрение в практическое здравоохранение и систему эпиднадзора метода ПЦР. На основе многолетних системных исследований группы возбудителей актуальных инфекционных заболеваний (ОКИ, хеликобактерная инфекция, НУГИ, вирусные гепатиты) получены новые данные о распространенности и особенностях циркуляции инфекционных агентов среди населения.

Разработаны оптимальные алгоритмы применения амплификационных методов для решения задач диагностики ОКИ, хеликобактерной инфекции, вирусных гепатитов, НУГИ. Определены роль и место данных технологий в общей системе диагностических исследований для наиболее рациональной и эффективной реализации последних.

Впервые разработаны экспериментальные лабораторные тест-системы для выявления бактерий рода Shigella, и генов токсинов энтеробактерий (термолабильного - LT; термостабильного - ST; шигатоксина первого типа - VT1).

Впервые установлено, что использование ПЦР при первичном обследовании больных с подозрением на ОКИ позволяет более чем в 2 раза увеличить эффективность выявления бактерий родов Shigella и Salmonella по сравнению с классическим микробиологическим исследованием.

Впервые в РФ проведен многолетний мониторинг (18 лет) клинических изолятов энтеробактерий. Установлены особенности циркуляции в Нижнем Новгороде штаммов энтеробактерий, содержащих гены факторов патогенности. Наиболее распространены варианты, имеющие оперон инвазивности (Shigella ssp., E.coli). Показано, что циркуляция токсигенных штаммов энтеробактерий не характерна для Нижегородского региона. Выявлены единичные случаи обнаружения гена шигаподобного токсина первого типа у представителей Shigella ssp., Е. coli. Впервые выявлен факт наличия у Е. coli 0127 генетических структур, сходных по нуклеотидной последовательности с геном адгезии холерного вибриона.

Показана широкая распространенность Н. pylori среди больных разных возрастов с различными типами гастродуоденальной патологии в Нижнем Новгороде (частота выявления 58,9±2,9% у детей и 82,9±1,8% у взрослых). Выявлена циркуляция токсигенных вариантов Н. pylori в бактериальной популяции. Варианты cagA + составили 76,4±3,8%, а варианты vakA + - 66,0±6,7% в популяции соответственно.

Определена активность репликации вирусов у больных хроническими гепатитами В и С разных возрастов при моноинфицировании, частота выявления вирусных нуклеиновых кислот составляла 48±2,4 - 50± 1,9%. Установлено, что эффективность репликации вирусов гепатитов В, С, D, G снижается при смешанном инфицировании (вирусные нуклеиновые кислоты выявлялись суммарно в 25,5±1,4 - 37,4±2,4% случаев в зависимости от состава ассоциации).

Определена вероятность вертикальной передачи вирусов гепатитов В и С в Нижнем Новгороде - 12,8±2,8% и 10,2±0,86% соответственно.

Впервые изучена циркуляция наиболее распространенных в Европе генотипов вируса гепатита С (la, lb, 2, За) на территории г. Нижнего Новгорода и Нижегородской области. Показано доминирование генотипов lb и За, частота их выявления несколько варьировала по годам от 48,4±3,6 до 54,3±3,4% и от 46,1±4,2 до 51,6±3,6% соответственно.

Исследованы особенности распространенности наиболее значимых возбудителей НУГИ - U. urealyticum, М. hominis, С trachomatis, Cytomegalovirus, Herpes simplex I/II. Они обнаружены у 68,0±1,3% женщин и 40,0±3,8% мужчин. Показано многолетнее стабильное сохранение распределения возбудителей по частоте выявления. В течение всего периода наблюдения чаще других обнаруживались U. urealyticum (54,2±1,4% у женщин, 29,7±3,6% у мужчин) и М. hominis (25,8±1,3% у женщин, 14,5±2,7% у мужчин). Остальные виды инфекционных агентов определялись существенно реже.

На основе анализа частоты выявления возбудителей НУГИ в разных возрастных группах установлены этапы колонизации макроорганизма уреаплазмами, микоплазмами и вирусами группы гепеса. Показана связь возбудителей НУГИ с нарушениями репродуктивной функции и воспалительными процессами в различных отделах урогенитального тракта.

На клонированные фрагменты генов термолабильного токсина (ЬТ) фактора адгезии (СРА1), которые впервые использованы в качестве ДНК зондов для выявления соответствующих генов и конструирования лабораторных вариантов ПЦР диагностикумов получены патенты Российской Федерации № 2031948; № 2049822 соответственно. Патент получен и на алгоритм использования метода ПЦР для выявления возбудителей НУГИ у детей первых лет жизни - №2271003.

Теоретическое значение работы.

Работа является одной из первых в Российской Федерации, в которой рассматриваются проблемы комплексного подхода к ПЦР диагностике инфекционных заболеваний, обусловленных широким спектром возбудителей.

Предложена система адаптации отечественных ПЦР тест-систем к решению задач практической медицины и эпиднадзора, а также разработки алгоритмов рационального использования метода ПЦР в диагностике актуальных инфекционных заболеваний.

Полученные новые данные о распространенности труднокультивируемых форм возбудителей расширяют представления об эпидемиологических особенностях ОКИ, хеликобактерной инфекции, НУГИ и вирусных гепатитах.

Предложенные алгоритмы диагностики НУГИ, ОКИ, парентеральных вирусных гепатитов, хеликобактерной инфекции с применением метода ПЦР могут быть использованы в дальнейшем при разработке новых диагностических стандартов. Перечни ведущих инфекционных агентов, предложенные для одновременного выявления при комплексной ПЦР- диагностике НУГИ и ОКИ могут служить основой комплектации мультиплексных ПЦР-тест-систем с детекцией продуктов амплификации методом биочипов.

Практическое значение работы.

Разработанные ДНК-зонды и созданные на их основе лабораторные варианты ПЦР систем впервые в Российской Федерации позволили проводить скрининг штаммов энтеробактерий на наличие генов факторов патогенности (термолабильного — LT; термостабильного - ST; шигатоксина первого типа - VT1) и детекцию бактерий рода Shigella и энтероинвазивных Escherichia в клиническом материале.

На основе авторских тест-систем, а также адаптации и модификации имеющихся отечественных ПЦР-диагностикумов, отработки схем их индивидуального и комплексного применения предложены алгоритмы использования метода ПЦР в диагностике бактериальных ОКИ, хеликобактерной инфекции, НУГИ и вирусных гепатитов.

Внедрение в практику разработанных алгоритмов позволили усовершенствовать этиологическую диагностику и систему эпиднадзора и мониторинга за возбудителями актуальных социально-значимых инфекционных заболеваний.

Оптимизация использования тест-систем, проведение одномоментного выявления наиболее распространенных и этиологически значимых инфекционных агентов, исследование пула потенциально инфицированных субстратов позволили в 1,5-2,5 раза повысить эффективность выявления возбудителей, уменьшить продолжительность и на 30-50% снизить стоимость исследований.

Предложенные нами принципы применения ПЦР в диагностике бактериальных ОКИ, хеликобактерной инфекции, НУГИ и вирусных гепатитов используются диагностическими лабораториями медицинских учреждений Н.Новгорода.