3.3. Задачи к разделу 3.

Задача 3.1. Аспартат-карбамоилтрансфераза катализирует следующую реакцию:

Аспартат + карбамоилфосфат → карбамоиласпартат + ортофосфат

и является первым ферментом при синтезе СТР. Активность фермента определяли по освобождению неорганического фосфата через определенные промежутки времени. Данные опытов, в которых определялась начальная скорость реакции при различных концентрациях аспартата и фиксированной концентрации карбамоилфосфата (3 мМ), приведены в табл. 3.1.

Таблица 3.1

Концентрация аспартата,мМ	Скорость, мкмольфосфата/ч
	нативный фермент	фермент после прогревания при 600 в течение 4 мин
1,0	0,15	0,4
2,0	0,25	0,6
2,5	0,3	0,85
4,0	0,7	1,2
5,0	1,1	1,4
7,5	1,7	1,95
10,0	2,2	2,4
15,0	2,95	3,0
20,0	3,05	3,1

Определить кинетические параметры: коэффициент Хилла, коэффициент крутизны, [S]0,5, Vmax для нативного и прогретого фермента.

Задача 3.2. Аспартат-карбамоилтрансфераза катализирует следующую реакцию:

Аспартат + карбамоилфосфат → карбамоиласпартат + ортофосфат

и является первым ферментом при синтезе СТР. Активность фермента определяли по освобождению неорганического фосфата через определенные промежутки времени. Данные опытов, в которых определялась начальная скорость реакции при различных концентрациях аспартата, фиксированной концентрации карбамоилфосфата (3 мМ) и фиксированной концентрации СТР (0,1 мМ) приведены в табл. 3.2.

Таблица 3.2

Концентрация аспартата,мМ	Скорость, мкмольфосфата/ч
	нативный фермент	Нативный фермент + 0,1 мМ СТР
1,0	0,15	0,025
2,0	0,25	0,10
2,5	0,3	0,125
4,0	0,7	0,35
5,0	1,1	0,5
7,5	1,7	1,03
10,0	2,2	1,6
15,0	2,95	2,5
20,0	3,05	2,9

Определить кинетические параметры для нативного фермента и фермента в присутствии СТР: коэффициент Хилла, коэффициент крутизны, Vmax, [S]0,5.

Задача 3.3. Аспартат-карбамоилтрансфераза катализирует следующую реакцию:

Аспартат + карбамоилфосфат → карбамоиласпартат + ортофосфат

и является первым ферментом при синтезе СТР. Активность фермента определяли по освобождению неорганического фосфата через определенные промежутки времени. Данные опытов, в которых определялась начальная скорость реакции при различных концентрациях аспартата, фиксированной концентрации карбамоилфосфата (3 мМ) и фиксированной концентрации СТР (0,1 мМ) приведены в табл. 3.3.

Таблица 3.3

Концентрация аспартата,мМ	Скорость, мкмольфосфата/ч
	нативный фермент	прогретый фермент + 0,1 мМ СТР
1,0	0,15	0,4
2,0	0,25	0,6
2,5	0,3	0,85
4,0	0,7	1,3
5,0	1,1	1,4
7,5	1,7	2,0
10,0	2,2	2,4
15,0	2,95	2,95
20,0	3,05	3,1

Определить кинетические параметры нативного и прогретого фермента: коэффициент Хилла, коэффициент крутизны, Vmax, [S]0,5.

Задача 3.4. Аспартат-карбамоилтрансфераза катализирует следующую реакцию:

Аспартат + карбамоилфосфат → карбамоиласпартат + ортофосфат

и является первым ферментом при синтезе СТР. Активность фермента определяли по освобождению неорганического фосфата через определенные промежутки времени. Данные опытов, в которых определялась начальная скорость реакции при различных концентрациях аспартата, фиксированной концентрации карбамоилфосфата (3 мМ) и фиксированной концентрации АТР (2мМ) приведены в табл. 3.4.

Таблица 3.4

Концентрация аспартата,мМ	Скорость, мкмольфосфата/ч
	нативный фермент	нативный фермент + 2 мМ АТР
1,0	0,15	0,4
2,0	0,25	0,55
2,5	0,3	0,9
4,0	0,7	1,35
5,0	1,1	1,4
7,5	1,7	2,0
10,0	2,2	2,4
15,0	2,95	3,0
20,0	3,05	3,1

Определить кинетические параметры нативного фермента и фермента в присутствии АТР: коэффициент Хилла, коэффициент крутизны, Vmax, [S]0,5.

Задача 3.5. Исследовалось влияние малеата на активность аллостерического фермента аспартат-карбамоилтрансферазы. В эксперименте использовался как нативный, так и прогретый фермент. Результаты, полученные в присутствии фиксированных концентраций аспартата и карьамоилфосфата (1 мМ и 3 мМ соответственно) и варьируемых концентраций малеата, приведены в табл. 3.5а.

Таблица 3.5а

Концентрация малеата, мМ	Скорость реакции, мкмоль фосфата/ч
	нативный фермент	прогретый фермент (600С, 4 мин)
0 0,25 0,5 0,75 1,0 2,0 5,0 10,0	0,15 0,25 0,285 0,30 0,255 0,16 0,08 0,06	0,4 0,32 0,23 0,20 0,18 0,10 0,075 0,05

Механизм ингибирования прогретого фермента изучали, изменяя концентрацию аспартата при двух фиксированных концентрациях малеата. Использовали различные концентрации фермента. Полученные результаты приведены в табл. 3.5б.

Таблица3.5б

[Аспартат], мМ	Скорость реакции, мкмоль фосфата/ч
	без малеата	1 мМ малеат	2 мМ малеат
5 8 10 20 25 40 100	0,77 0,95 1,05 1,25 1,33 1,43 1,54	0,43 0,61 0,69 0,95 1,05 1,25 1,43	0,28 0,44 0,51 0,77 0,87 1,05 1,33

Какие выводы о регуляции активности фермента можно сделать на основании полученных данных?

Задача 3.6. Исследована кинетика действия глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы из азотфиксирующих бактерий Azotobacter beijerinckii.

Глюкозо-5-фосфат + NADP⁺ ↔ 6-фосфоглюконат + NADPH + H⁺

Изучено влияние АТР на активность фермента. Получены приведенные ниже данные о зависимости начальной скорости реакции от концентрации глюкозо-6-фосфата в отсутствие и в присутствии АТР (при трех различных концентрациях); во всех опытах количество фермента (по белку) 0,75 мкг (табл. 3.6).

Таблица 3.6

[Глюкозо-6-Р], мМ	Начальная скорость восстановления NADP+, нмоль/мин
	концентрация АТР, мМ
	0	1,25	0,625	0,3125
0,375 0,500 0,625 0,750 0,875 1,000 1,250 1,500 1,750 2,000 2,250 2,500	5,15 9,65 10,95 14,15 15,45 18,65 22,70 23,80 ­ 27,00 ­ 29,00	0,35 0,43 0,58 0,97 1,29 2,25 3,54 5,15 8,05 9,83 12,90 16,60	0,64 0,97 ­ 2,75 ­ 5,47 8,69 10,60 14,80 16,10 ­ 16,70	1,48 1,93 ­ 5,15 ­ 9,97 13,00 15,10 ­ ­ ­ 26,40

По данным табл. 3.6 построить график в координатах v ; [S] и определить по нему Vmax. Для рассматриваемой системы Vmax = 29,5 нмоль/мин. Для определения коэффициента h (коэффициента взаимодействия, коэффициента Хилла) необходимо построить график Хилла.

Задача 3.7. Исследовалась кинетика глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в гемолизатах клеток красной крови кроликов.