1. Характеристика кинетических констант

В уравнении Михаэлиса есть два кинетических параметра, имеющих важное значение для характеристики любого фермента. Это константа Михаэлиса и максимальная скорость реакции. Константа Михаэлиса определяется соотношением констант (k_-1+k₊₂/k₊₁), а величина V_max, называемая максимальной скоростью, ‒ произведением k₊₂ [E]₀.

Константа Михаэлиса численно равна концентрации субстрата, при которой начальная скорость ферментативной реакции равна половине максимальной. Высокое сродство фермента к субстрату характеризуется низкой величиной К_m и наоборот, низкое сродство – высокой величиной К_м.

Величина V_max не является фундаментальной характеристикой фермента, поскольку зависит от его концентрации. Если концентрация фермента известна, то целесообразно ввести величину k_cat – каталитическую константу (или число оборотов фермента), определяемую выражением V_max/[E]₀. Для механизма Михаэлиса k_cat идентична k₊₂, однако в общем случае лучше пользоваться менее определенным обозначением, а именно k_cat.

Константу k_кат называют еще «числом оборотов» поскольку она соответствует числу молекул субстрата, превращаемых в продукт одной молекулой фермента за 1 с. Отношение констант k_cat/К_м называют константой специфичности фермента.

2. Методы определения Км и Vmax

Константу Михаэлиса можно определить из графика Михаэлиса (рис.1.1), найдя графическим способом максимальную скорость и соответствующую величину концентрации субстрата, при которой скорость ферментативной реакции будет вдвое меньше V_max. Эта величина [S] и будет К_м. Таким способом можно определить только приблизительную величину константы Михаэлиса из-за трудности точного графического определения Vmax.

Более удобными являются методы, в которых осуществлена линеаризация уравнения Михаэлиса-Ментен, т. е. гиперболическая зависимость v от [S] переведена в линейную.

Для того чтобы построить такой график, необходимо определить в одинаковых условиях при различных концентрациях субстрата и [E]= const начальные скорости ферментативной реакции.

Метод Лайнуивера-Берка. Один из способов линеаризации уравнения Михаэлиса-Ментен предложили Лайнуивер и Берк (Lineweaver H., Burk D.)). Это так называемый метод двойных обратных величин. Для линеаризации необходимо взять обратные величины от левой и правой частей уравнения (), в результате чего оно преобразуется в уравнение вида

согласно которому между величинами, обратными начальной скорости (1/v, v^-1) и концентрации субстрата (1/[S], [S]^-1) соблюдается линейная зависимость, если механизм реакции подчиняется изложенным выше представлениям (рис.1.2).

Рис. 1.2. График зависимости 1/v от 1/[S] (график Лайнуивера-Берка)

Экспериментальная прямая пересекает ось абсцисс в точке (-1/[S] = 1/К_м), а ось ординат – в точке (1/v = 1/V_мах). Тангенс угла наклона равен К_м/V_мах. Этим широко пользуются для определения параметров К_м и V_мах, характеризующих связывающую и каталитическую функции ферментов.

Метод Хайнса-Вульфа. В этом случае преобразуется уравнение Лайнуивера-Берка путем умножения правой и левой частей на концентрацию субстрата.

Графическая зависимость приведена на рис.1.3.

Рис. 1.3. График зависимости [S]/v от [S] (график Хайнса-Вульфа)

Это прямая с наклоном 1/V_max, отсекающая на осях [S]/v и [S] отрезки К_м/ V_max и – Км соответственно.

Метод Иди-Хофсти. При одном из таких графических преобразований в так называемом графике Иди-Хофсти (pиc.2.3.5) строят график зависимости v от v/[S]. В этом случае точка пересечения прямой, полученной путем наилучшей линейной аппроксимации экспериментальных точек, с осью ординат соответствует V_max, а тангенс угла наклона равен – K_m. Данный способ линеаризации приведен на рис. 1.4.

Рис. 1.4. График зависимости v от v/[S] (график Эди-Хофсти)

Метод Эйзенталя и Корниш-Боудена. Много позднее Эйзенталь и Корниш-Боуден предложили иной метод графического представления результатов исследования кинетики ферментативных реакций – так называемый прямой линейный график. Уравнение Михаэлиса-Ментен они преобразовали в виде зависимости V_max от К_м:

К_М = v + v/[S] V_MA

Для любой пары значений [S] и v можно построить зависимость V_max от К_м. Она представляет прямую с наклоном, равным v/[S], и отрезками, отсекаемыми на осях К_м и V_max, соответственно равными – [S] v. Если провести прямые для нескольких пар значений [S] и v, то эти прямые пересекутся в одной точке, координаты которой дадут единственные значения V_max от К_м, удовлетворяющие всем парам значений [S] и v (рис.1.5).

Рис.1.5. Определение кинетических констант – Км и Vmax по методу Эйзенталя и Корниш-Боудена

Преимущества такого графика очевидно: для его построения не требуется никаких расчетов, он позволяет очень просто выявить ошибочные данные (такие прямые будут выпадать из основной совокупности прямых).

Уравнение Михаэлиса лежит в основе всех кинетических исследований ферментативных реакций, так как оно позволяет рассчитать количественные характеристики ферментов и проводить анализ их ингибирования. Величины К_m и V_max являются важнейшими характеристиками ферментов и их можно определить, используя линеаризованные формы уравнения Михаэлиса-Ментен.

Графические методы для определения V_max и К_m не являются оптимальными. В настоящее время данные ферментативной кинетики обрабатывают быстрее и более объективно с помощью компьютерных программ.