2.7. Задачи к разделу 2.

Задача 2.1. Исходя из данных табл. 2.1, определите характер ингибирования, Km и Vmax в присутствии и отсутствии ингибитора. Определить ингибиторную константу методом Диксона.

Таблица 2.1

[S], мМ	Скорость, мкмоль/мин
	Концентрация ингибитора
	0	1,5	3,0	4,5
0,20	0,32	0,17	0,12	0,09
0,73	1,10	0,60	0,35	0,35?
1,26	1,50	0,87	0,77	0,60
1,78	1,96	1,20	0,81	0,65
2,31	2,22	1,61	1,12	0,98
2,84	2,40	1,62	1,40	1,31
3,36	2,85	2,00	1,51	1,35
3,90	2,65	1,80	1,73	1,44
4,42	2,80	2,56	2,12	1,47
4,94	3,24	2,58	1,82	1,72

Задача 2.2. Измеряли кинетику ферментативной реакции в зависимости от концентрации субстрата в присутствии или отсутствие ингибитора I и II. Были получены следующие данные (табл. 2.2):

Таблица 2.2

[S], 10 -5 M	Скорость, мкмоль/мин
	Без ингибитора	С ингибитором I	С ингибитором II
0,3	10,4	4,1	2,1
0,5	14,5	6,4	2,9
1,0	22,5	11,3	4,5
3,0	33,8	22,6	6,8
9,0	40,5	33,8	8,1

Задача 2.3. Определить К_м и V_max в присутствии и отсутствии ингибитора, исходя из данных, приведенных в табл. 2.3. Установить тип ингибирования.

Таблица 2.3

[S], мМ	v, ммоль/мин
	контроль	ингибитор
1,25	1,72	0,98
1,67	2,04	1,17
2,50	2,63	1,47
5,00	3,33	1,96
10,00	4,12	2,38

Задача 2.4. Влияние оксамата натрия на скорость реакции, катализируемой лактатдегидрогеназой из Lactobacillis plantarum, изучали следующим образом.

2 мл трис-буфера, рН 8,0 и 0,2 мл 2 мМ раствора NADH добавляли в десять спектрофотометрических кювет. К пяти кюветам добавляли 0,1 мл 15 мМ раствора оксамата натрия. Во все кюветы добавляли различные объемы 0,6 мМ раствора пирувата натрия. Конечный объем проб доводили дист. водой до 2,9 мл. Реакцию запускали добавлением 0,1 мл раствора лактатдегидрогеназы измеряли оптическую плотность при 340 нм через мин после перемешивания и затем с интервалом в 1 мин. Полученные результаты оптических плотностей приведены в табл. 2.4.

Таблица 2.4

Время, мин	оптическая плотность при 340 нм
	объем пирувата, мл
	без оксамата					с оксаматом
	0,02	0,03	0,05	0,100	0,200	0,02	0,03	0,05	0,100	0,200
1	0,800	0,804	0,776	0,772	0,726	0,788	0,803	0,803	0,780	0,760
2	0,776	0,768	0,721	0,633	0,583	0,776	0,784	0,776	0,729	0,683
3	0,750	0,727	0,668	0,544	0,460	0,764	0,765	0,748	0,681	0,608
4	0,724	0,692	0,617	0,460	0,350	0,751	0,745	0,721	0,627	0,532

Определить тип ингибирования. Рассчитайте величины К_М и V_MAX в присутствии и без ингибитора.

Задача 2.5. Гликоген – это полисахарид, состоящий из остатков глюкозы. Гликогенсинтаза – фермент, ответственный за наращивание молекулы гликогена по следующей реакции:

UDP-глюкоза + (глюкоза)_n → (глюкоза)_{n + 1} + UDP

В табл. 2.5 приведены результаты двух опытов по каталитическому действию гликогенсинтазы, в которых менялась концентрация UDP-глюкозы, а концентрация полисахарида (акцептора) сохранялась постоянной. В одном опыте к реакционной смеси добавляли только полисахарид, а в другом – еще и ATP (2,5 ммоль/л). С помощью графического анализа определите вид ингибирования фермента ATP и рассчитайте кинетические константы.

Таблица 2.5

UDP-глюкоза, ммоль/л	Содержание (глюкоза)n+1 (начальная скорость), мкмоль/мин
	Без АТР	С добавлением АТР
0,8	10,0	2,0
1,4	12,5	3,3
3,3	22,0	6,7
5,0	25,0	10,0

Задача 2.6. Исходя из данных табл. 2.6, определите тип ингибирования, Км и Vmax.

Таблица 2.6

[S], М	Скорость реакции, мкмоль л -1мин-1
	Без ингибитора	С ингибитором
27 10-7	11,96	7,80
45 10-7	16,68	10,11
91 10-7	25,88	12,99
27 10-6	38,87	16,04
81 10-6	46,58	17,41

Задача 2.7. Декарбоксилирование глиоксилата митохондриями ингибируется малонатом. При кинетическом исследовании были получены следующие результаты (табл. 2.7). Определите тип ингибирования, Км, Vmax и величины Кi для двух концентраций малоната.

Таблица 2.7

Концентрация глиоксилата, мМ	Скорость выделения СО2 условные единицы)
	в отсутствие малоната	[малонат], 1,26 мМ	[малонат], 1,96 мМ
1,00	2,50	2,17	1,82
0,75	2,44	1,82	1,39
0,60	2,08	1,41	1,28
0,50	1,89	1,30	1,00
0,40	1,67	1,09	-
0,33	1,39	-	-
0,25	1,02	-	0,56

Задача 2.8.. Глутаматдегидрогеназа катализирует следующую реакцию:

L-глутамат + NAD⁺ ↔ α-кетоглутарат + NADH +H⁺ + NH₃

За ходом реакции можно следить по поглощению при 340 нм. При изучении влияния салицилата натрия на приведенную реакцию были получены следующие данные (табл. 2.8).

Таблица 2.8

Концентрация глутамата,мМ	Δ А340/мин
	в отсутствие ингибитора	в присутствии 40 мМ салицилата
1,5	0,21	0,08
2,0	0,25	0,10
3,0	0,28	0,12
4,0	0,33	0,13
8,0	0,44	0,16
16,0	0,40	0,18

Определить графически тип ингибирования. Найти Vmax, К_М и К_i (константу диссоциации комплекса фермент-ингибитор).

Задача 2.9. Альфа-кетоглутарат является конкурентным ингибитором реакции окисления N-метил-L-глутамата, катализируемого N-метилглутаматдегидрогеназой. Определить константу диссоциации комплекса фермент-ингибитор, исходя из данных табл. 2.9. [E]_o= 6*10^-2 мг/мл.

Таблица 2.9

[α-кетоглутарат]·10-3 М	[S]*10-4 М	vo·10-6 M·мин-1
0	1,00	1,67
	0,625	1,43
	0,500	1,33
	0,417	1,25
	0,264	1,00
0,6	1,67	1,67
	1,00	1,43
	0,625	1,18
	0,500	1,04
	0,330	0,83
3,0	5,00	1,56
	1,67	1,00
	1,00	0,77
	0,667	0,57
	0,500	0,45

Задача 2.10. Анализировали кинетику фермента в присутствии ингибитора, добавленного в концентрации 10^-4 М (табл. 2.10):

Таблица 2.10

[S] , 10 -5 M	Скорость реакции, мкмоль/мин
	без ингибитора	с ингибитором
0,3	10,4	2,1
0,5	14,5	2,9
1,0	22,5	4,5
3,0	33,8	6,8
9,0	40,5	8,1

а) Каковы значения К_М и V_MAX в присутствии ингибитора? Cравните их с величинами, полученными в задаче 2-1.

б) Каков тип ингибирования?

в) Какова константа диссоциации этого ингибитора?

г) При [S] = 3 х 10^-5 М какая доля молекул фермента связана с субстратом в присутствии 10^-4 М ингибитора? В отсутствие его?

Задача 2.11. Анализировали кинетику фермента, рассмотренного в задаче 2.10, в присутствии другого ингибитора, добавленного в концентрации ?????

Таблица 2.11

[S]10-5, М	Скорость реакции, мкмоль/мин
	без ингибитора	с ингибитором
0,3	10,4
0,5	14,5
1,0	22,5
3,0	33,8
9,0	40,5

а) Каковы значения К_М и V_MAX в присутствии ингибитора? Cравните их с величинами, полученными в задаче 2-1.

б) Каков тип ингибирования?

в) Какова константа диссоциации этого ингибитора?

г) При [S] = 3 х 10^-5 М какая доля молекул фермента связана с субстратом в присутствии 10^-4 М ингибитора? В отсутствие его?

Задача 2.12. Исходя из данных табл. 2.12, определить Km и Vmax в присутствии и отсутствии ингибитора. Каков характер ингибирования? Определить ингибиторную константу методом Диксона.

Таблица 2.12

[S], мМ	Скорость, мкмоль/мин
	Концентрация ингибитора
	0	1,5	3,0	4,5
0,20	0,32	0,17	0,12	0,09
0,73	1,10	0,60	0,35	0,35?
1,26	1,50	0,87	0,77	0,60
1,78	1,96	1,20	0,81	0,65
2,31	2,22	1,61	1,12	0,98
2,84	2,40	1,62	1,40	1,31
3,36	2,85	2,00	1,51	1,35
3,90	2,65	1,80	1,73	1,44
4,42	2,80	2,56	2,12	1,47
4,94	3,24	2,58	1,82	1,72

Задача 2.13. Реакция расщепления крахмала α-амилазой ингибируется продуктами гидролиза мальтозой и α-декстрином. Исходя из данных, приведенных в табл. 2.13, установите тип ингибирования и вычислите соответствующие значения К_М и V_MAX.

Таблица 2.13

Ингибитор	Концентрация ингибитора, мг/мл	Концентрация субстрата, мг/мл
		11,52	5,76		2,88		1,44
		Относительная скорость гидролиза
Нет	0,00	100		82		56	39
Мальтоза	6,35	90		77		50	36
	12,70	82		66		46	31
	25,40	67		57		38	27
α-декстрин	1,67	105		78		49	32
	3,34	100		76		45	28
	6,68	100		70		37	23

Задача 2.14. Из приведенных ниже данных для ферментативной реакции (табл. 2.14) определите, является ли действие ингибитора конкурентным или неконкурентным. Вычислите также величину К_М и V_MAX для фермента.

Таблица 2.14

[S], мМ 2,0 3,0 4,0 10,0 15,0

Скорость образования продукта в отсутствие 139 179 213 313 370 ингибитора, мкг ч-1

Скорость образования продукта в присутствии 88 121 149 257 313 ингибитора, мкг ч

Задача 2.15. Фермент Х расщепляет субстрат А с образованием продукта В. Соединения С и D ингибируют реакцию. В рассматриваемом ниже эксперименте под действием определенного (постоянного) количества фермента Х происходит превращение А в В в присутствии С или D. Концентрации выражены в мкмоль/мл, начальные скорости реакций – в мкмолях А, превращенного за 1 мин 1 мл раствора. На основании информации, приведенной в табл. 2.15, сделайте мотивированное заключение о типе ингибирования, вызываемом С и D.

Таблица 2.15

[C], мМ	Скорость		[D], мМ	Скорость
	[А] = 8 мМ	[А] = 24 мМ		[А] = 8 мМ	[А] = 24 мМ
0	5,0	10,0
1,0	3,4	­	0	5,0	10,0
2,5	2,3	4,5	1,0	2,3	_
4,0	­	3,6	2,5	1,3	5,4
5,0	1,6	3,1	4,0	­	4,2
7,0	1,2	2,4	5,0	0,7	3,5
			7,0	0,6	2,7

Задача 2.16. Исследовалось влияние β-фтормалата на активность малатдегидрогеназы. Условия проведения эксперимента: 1 мл раствора фермента и 0,5 мл фосфатного буфера добавляли в восемь кварцевых пробирок сечением 1 см². В четыре пробирки добавляли по 0,3 мл 0,5 мМ раствора β-фтормалата (смесь двух стереоизомеров). Затем во все пробирки добавляли различные объемы 0,5 мМ раствора оксалоацетата, объем проб доводили до 2,8 мл водой и перемешивали. Реакцию начинали добавлением 0,2 мл 1 мМ раствора NADH и измеряли оптическую плотность при 340 нм сразу же после добавления кофермета и затем через каждые 2 мин. Полученные результаты приведенв в табл. 2.16.

Таблица 2.16

Время. мин	Оптическая плотность при 340 нм
	объем оксалоацетата, мл
	без фтормалата				в присутствии фтормалата
	0,10	0,15	0,30	0,60	0,10	0,15	0,30	0,60
0	0,415	0,413	0,411	0,407	0,416	0,417	0,415		0,414
2	0,387	0,380	0,370	0,358	0,400	0,396	0,385		0,376
4	0,358	0,346	0,329	0,312	0,383	0,375	0,355		0,337
6	0,332	0,314	0,281	0,269	0,368	0,355	0,325		0,301
8	0,320	0,283	0,250	0,225	0,352	0,335	0,296		0,263

Является ли фтормалат ингибитором? Если да, то определите значение его Кi.

Задача 2.17. Определите К_i по данным зависимости v от [I] при двух концентрациях субстрата. При определении ингибиторной константы для ионов ацетата, действующих на гидролитический фермент, были получены приведенные ниже данные (для уксусной кислоты и ацетата натрия соответственно, табл. 2.17). Какие заключения качественного и количественного характера можно сделать на основании этих данных? Реакцию проводили при 25⁰ С в 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,4), скорость реакции выражали числом микромолей субстрата, гидролизованного за 1 мин на 1 мг белка.

Таблица 2.17

Концентрация субстрата 3 мМ
Концентрация ацетата или ацетата натрия, М	0	0,03	0,06	0,09	0,12	0,15	0,18	0,21	0,24
v реакции при добавлении ацетата	1,64	1,33	1,14	0,99	0,85	0,64	0,50	0,425	0,30
v реакции при добавлении ацетата натрия	1,64	1,33	1,15	1,00	0,89	0,81	0,735	0,675	0,625
Концентрация субстрата 5 мМ
Концентрация ацетата или ацетата натрия, М	0	0,03	0,06	0,09	0,12	0,15	0,18	0,21	0,24
v реакции при добавлении ацетата	2,1	1,79	1,59	1,40	1,23	1,08	0,83	0,61	0,42
v реакции при добавлении ацетата натрия	2,1	1,79	1,60	1,45	1,30	1,18	1,09	1,01	0,94

Задача 2.18. На основании данных, приведенных в таб. 2.18 определить константу Михаэлиса и максимальную скорость реакции в отсутствии ингибитора. Принимая во внимание, что количество фермента одинаково в каждом варианте эксперимента, а ингибитор А и В присутствуют в концентрации 10 мМ, определить для каждого ингибитора тип ингибирования и ингибиторную константу Ki.

Таблица 2.18

[S], mM	v, ( моль/с) без ингибитора	v, (моль/с) ингибитор A	v, (моль/с) ингибитор B
1	2.5	1.17	0.77
2	4.0	2.1	1.25
5	6.3	4.0	2.0
10	7.6	5.7	2.5
20	9.0	7.2	2.86

Задача 2.19. Измеряли начальную скорость ферментативной реакции как функцию концентрации субстрата в отсутствии и присутствии ингибитора и получили следующие данные (рис. 2.19).

Таблица 2.19

[S], М	v, моль мин-1	v, моль мин-1
	без ингибитора	в присутствии ингибитора
0,0001	33	17
0,0002	50	29
0,0005	71	50
0,001	83	67
0,002	91	80
0,005	96	91
0,01	98	95
0,02	99	98
0,05	100	99
0,1	100	100

1. Чему равна Vmax в отсутствие ингибитора?

2. Чему равна Км в отсутствие ингибитора?

3. При [S]=0,0004 М какова будет скорость в отсутствие ингибитора?

4. При [S]=0,0004 М какова будет скорость в присутствии ингибитора?

5. В отсутствие ингибитора, какая часть фермента будет связана с субстратом, если [S]=0,0004 М?

Задача 2.20. Исследовали скорость ферментативной реакции в отсутствии и присутствии ингибитора при различных концентрациях субстрата. Полученные данные представлены в табл.2.20.

Таблица 2.20

[S], мМ	v, моль/мин
	контроль	ингибитор
1,25	1,72	0,98
1,67	2,04	1,17
2,50	2,63	1,47
5,00	3,33	1,96
10,00	4,12	2,38

Определить Vmax и Km в присутствии и отсутствии ингибитора, тип ингибирования.

Задача 2.21. 3,4-Дихлорфенилэтаноламин является одновременно субстратом и ингибитором реакции трансметилирования, катализируемой фенилэтаноламин-N-метилтрансферазой. На основании данных, приведенных в табл. 2.21, определите кинетические параметры реакции (Км, Кs′, Vmax, [S]opt.

Таблица 2.21

[S] 10-6, М	v0 10-10, М мин-1	[S] 10-6, М	v0 10-10, М мин-1
1,00	4,00	10,0	5,16
1,14	4,25	25,0	3,85
1,33	4,55	50,0	2,82
1,60	4,76	75,0	2,33
2,00	5,00	100,0	1,79
2,67	5,26	125,0	1,47
5,00	5,45	150,0	1,28

Задача 2.22. Реакция гидролиза йодида N-метил-7-ацетоксихинолина, катализируемого ацетилхолинэстеразой, ингибируется субстратом. Исходя из данных табл. 2.22, определите кинетические параметры ферментативной реакции: Км, Vmax, Ks′, [S]opt. (Условия опыта: рН 6,85; 25⁰С; 0,05 М фосфатный буфер; 1,6% метанола).

Таблица 2.22

[S] 10-5, М	v0, условн. ед.	[S] 10-5, М	v0, условн.ед.
0,125	0,174	2,0	0,735
0,143	0,195	5,0	0,833
0,167	0,220	10,0	0,800
0,200	0,254	20,0	0,715
0,250	0,300	30,0	0,645
0,333	0,364	40,0	0,572
0,500	0,465	50,0	0,514
1,000	0,625	60,0	0,476
		70,0	0,431

Задача 2.23. Изофермент ЛДГ1, выделенный и очищенный из cтарых эритроцитов кролика, ингибируется высокими концентрациями пирувата. На основании данных, приведенных в табл. 2.23, определите кинетические характеристики реакции, катализируемой этим изоферментом: Км, Vmax, Ks′, [S]opt. Концентрация NADH – 80 мкМ.

Таблица 2.23

[пируват], мкМ	v, мкмоль/мин/мг белка
20	15
40	33
80	49
160	68
320	74
640	66
1280	45

Задача 2.24. Реакция восстановления пирувата, катализируемая лактатдегидрогеназой, ингибируется высокими концентрациями субстрата. На основании данных табл. 2.24 определите Км, Vmax, Кs′ и [S]opt данной ферментативной реакции. (Условия опыта: рН 6,80; 27,5 ⁰С; 0,05 М фосфатный буфер; [NADH] = 1,29 10^-5 М; [E]₀ = 2 10^-5 мг/мл).

Таблица 2.24

[S] 10-3, М	v0 10-6, М мин-1	[S] 10-3, М	v0 10-6, М мин-1
0,020	3,15	0,70	4,30
0,029	3,70	1,10	3,90
0,040	4,10	3,00	2,40
0,050	4,39	5,00	1,80
0,100	4,92	7,00	1,50
0,500	4,90	10,00	1,10

Задача 2.25. n-Нитроанилид N-бензоил-Lаргинина является одновременно субстратом и ингибитором гидролиза, катализируемого трипсиноподобным ферментом микробного происхождения. Исходя из данных табл. 2.25, найти кинетические параметры ферментативной реакции. Условия опыта: рН 9,0, 25⁰ С.

Таблица 2.25

[S], 10-5 М	v/[E0], c-1	[S], 10-5 М	v/[E0], c-1
1,98	4,15	20,0	7,50
2,50	4,65	50,0	6,91
3,00	5,13	100	5,72
4,00	5,89	200	4,22
6,00	6,63	300	3,30
8,00	7,15	396	2,74
10,0	7,15

Задача 2.26. Скорость реакции гидролиза )-(бензоилглицин) -2- оксиизовалериановой кислоты, катализируемой карбоксипептидазой А, уменьшается в присутствии избытка субстрата. Исходя из данных табл. 2.26, определите кинетические и равновесные параметры. Условия опыта: рН 7,5; 25⁰ С; [Eo] = 6,1 10^-10 – 1,2 10^-8 М.

Таблица 2.26

[S] 10-4, M	v/[E]o, с-1	[S] 10-4, M	v/[E]o, с-1	[S] 10-4, M	v/[E]o, с-1
0,400 0,445 0,500 0,572 0,667 0,800 1,000 1,410 1,780	9,57 10,50 11,50 12,80 14,50 16,70 19,60 25,00 28,00	2,00 3,16 4,00 5,62 10,00 10,60 16,80 17,80 24,00	29,2 33,8 35,6 36,2 34,7 33,4 29,2 28,4 24,8	31,6 44,7 56,2 74,1 100,0 141,0 178,0 316,0 562,0	21,00 16,70 15,00 12,50 10,60 8,35 7,50 5,83 4,80

Задача 2.27. При изучении кинетики гидролиза монофенилфосфата, катализируемого щелочной фосфатазой, было найдено, что субстрат является одновременно и ингибитором ферментативной реакции. На основании данных табл. 2.27 определить кинетические и равновесные параметры ферментативного гидролиза. Условия опыта: Рн 10,0; 37⁰ С; [E]_o = 4 10^-3 мг/мл.

Таблица 2.27

[S] 10-3, М	V 10-5 , моль мин-1
0,5 1,0 2,0 4,0 5,0 6,0 7,0 10 12	1,60 2,80 4,10 4,65 4,64 4,36 3,45 2,60 1,84

Задача 2.28. При увеличении концентрации субстрата в реакции гидролиза N-карбобензокси-L-триптофана, катализируемого карбоксипептидазой, скорость ферментативной реакции проходит через максимум, затем снижается и достигает постоянного уровня (табл.2.28). Определить значения кинетических и равновесных параметров реакции. Условия опыта: рН 7,5; 5⁰ С; 0,04 М фосфатный буфер; 0,5 М KCl.

Таблица 2.28

[S]10-3 М	v/[E]o, c-1	[S]10-3 М	v/[E]o, c-1
2,00 2,22 2,50 2,86 3,33 4,00 5,00 6,67 10,00	7,70 8,33 9,00 9,80 10,80 11,80 12,80 13,90 14,90	20,0 39,0 50,0 70,0 76,0 98,0 101,0 130,0 150,0	15,0 13,6 12,8 12,0 11,8 10,9 11,0 10,9 10,8