3. Задачи к разделу 1

Задача 1.1.. Определить кинетические параметры реакции, катализируемой фосфоглюкомутазой, исходя из данных, приведенных в табл.1.

Таблица 1.1

[Глюкозо-1-фосфат], мкМ	v, мкмоль/мин*мг белка
2,5	31,2
5,0	53,3
10	74,5
20	94,0
40	123,3
80	139,2
160	152,4

Задача 1.2. Исходя из данных, приведенных в табл. 1.2, определить Км и Vmax данной ферментативной реакции.

Таблица 1.2

[S], мМ	v, мкмоль продукта/мин
1	0,9
2	1,4
5	1,9
10	2,3
50	2,6
100	2,8

Задача 1.3. Измеряли кинетику реакции, катализируемой сукцинатдегидрогеназой, в зависимости от концентрации янтарной кислоты. Данные приведены в табл. 1.3. Определите константу Михаэлиса и максимальную скорость данного ферментативного процесса.

Таблица 1.3

[сукцинат] *10-5М	v,мкмоль/мин
0,2	4,1
0,4	6,4
0,6	8,7
0,8	11,0
1,0	12,0
3,0	22,6
9,0	33,8
15,0	34,5
21,0	34,6

Задача 1.4. Исходя из данных табл. 1.4, определить кинетические параметры (К_М, V_MAX и k_cat) гидролиза субстрата (метилового эфира N-ацетил-L-норвалина), катализируемого α-химотрипсином [E]₀ = 2,62 10^-7 М.

Таблица 1.4

[S] 10 -2 М	v 10 -7 M сек-1
4,00	9,70
2,00	7,85
1,33	6,46
1,00	5,50
0,80	4,80

Задача 1.5. Измеряли кинетику ферментативной реакции, катализируемой рибонуклеазой, в зависимости от концентрации РНК. Данные приведены в табл. 1.5. Определить кинетические характеристики реакции (К_М и V_MAX).

Таблица 1.5

[РНК]*10-4 М	v, мкмоль/мин	[РНК]*10-4 М	v, мкмоль/мин
0,1	1,3	3,0	6,8
0,3	2,1	9,0	8,1
0,5	2,9	15,0	8,5
0,7	3,5	18,0	8,6
1,0	4,5

Задача 1.6. Измеряли кинетику реакции, катализируемой каталазой в зависимости от концентрации пероксида водорода. Полученные данные приведены в табл. 1.6. Определите К_М и V_MAX.

Таблица 1.6

[H2O2], M	v, мкмоль/мин
0,3 *10-5	10,4
0,5 *10-5	14,5
1,0 *10-5	22,5
3,0 *10-5	33,8
9,0 *10-5	40,5
13,0*10-5	41,5
16,0*10-5	41,6

Задача 1.7. Определить кинетические свойства фермента, исходя из данных приведенных в табл. 1.7.

Таблица 1.7

[S] ,М 10-4	v0 , моль/мин/мг белка
0,25	1,0
0,50	1,7
1,00	2,5
20,00	5,0
50,00	5,2

Задача 1.8. Определить кинетические характеристики очищенного препарата печеночной глюкокиназы по данным, приведенным в табл. 1.8.

Таблица 1.8

[глюкоза], мМ	v, U/мг белка	[глюкоза], мМ	v, U/мг белка
1,00	13,3	20,25	85,0
2,00	24,0	27,00	92,0
3,60	38,0	32,40	97,0
5,40	48,0	36,45	98,0
10,80	67,0	38,25	98,5
14,85	76,0

Задача 1.9. При определении каталитической активности пептидазы из тонкого кишечника, гидролизующей дипептид глицилглицин:

Глицилглицин + Н₂О → 2 глицин

были получены следующие экспериментальные данные (табл. 1.9) Определите графически величины К_М и V_MAX.

Таблица 1.9

[S], мМ	1,5	2,0	3,0	4,0	8,0	16,0	24
Продукт, мг/мин	0,21	0,24	0,28	0,33	0,40	0,45	0,46

Задача 1.10. Определить кинетические свойства фермента, исходя из данных приведенных в таблице 1.10.

Таблица 1.10

[S] ,мкмоль л-1	v0 , мкмоль л-1мин-1	[S] ,мкмоль л-1	v0 , мкмоль л-1мин-1
0,020	0,19	0,20	0,83
0,025	0,22	0,50	1,17
0,04	0,32	1,00	1,41
0,10	0,59	2,00	1,63

Задача 1.11. Определить кинетические свойства фермента, исходя из данных приведенных в таблице 1.11.

Таблица 1.11

[S] ,мкмоль л-1	v0 , мкмоль л-1мин-1
0,5	50,0
1,0	75,0
2,0	100,0
3,0	112,5
10,0	136,4

Задача 1.12. Определить кинетические параметры (К_М, V_MAX, k₊₂) гидролиза этилового эфира N-транс-циннамоил-L-тирозина, катализируемого α-химотрипсином, исходя из данных табл.1.12. Условия опыта: рН 7,8; 25⁰С; [Е]₀ = 3,1*10^-9 М.

Таблица 1.12

[S]010-4, M	v0*10-7, М*сек-1
3,6	1,94
1,8	1,84
1,2	1,75
0,90	1,67
0,72	1,59

Задача 1.13. Определить кинетические свойства фермента, исходя из данных приведенных в таблице 1.13.

Таблица 1.13

[S], ммоль л-1	v0, ммоль л-1мин-1
1,25	1,72
1,67	2,04
2,50	2,63
5,00	3,33
10,00	1,12

Задача 1.14. Исходя из данных, приведенных в таблице 1.14, определите К_М и V_MAX для ферментативной реакции.

Таблица 1.14

[S], М	v0, мкмоль/л мин	[S], М	v0, мкмоль/л мин
2,5 10-6	28	4,0 10-5	112
4,0 10-6	40	1,0 10-4	128
1,0 10-5	70	2,0 10-3	139
2,0 10-5	95	1,0 10-2	140

Задача 1.15. Фермент глутаматдегидрогеназа катализирует реакцию

L-глутамат + NAD⁺ → α-оксоглутарат + NADH + H⁺ + NH₃

Кинетические данные (изменение начальной скорости от концентрации L-глутамата) приведены в табл. 1.15). Начальная концентрация NAD⁺ во всех опытах постоянна. Найдите К_М и V_MAX этой реакции.

Таблица 1.15

[L-глутамат], ммоль/л	v0 (ΔА340 нмоль/мин)
1,68	0,172
3,33	0,250
5,00	0,286
6,67	0,303
10,00	0,334
20,00	0,384

Задача 1.16. В таблице 1.16 представлены данные, показывающие зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата.

Таблица 1.16

[S], М	Скорость реакции, мкмоль/мин
1*10-6 1*10-5 1*10-4 1*10-3	20 32 39 40

Используя данные таблицы:

а) нарисуйте график зависимости скорости реакции от концентрации субстрата;

б) найдите значение V mах и Км.

Чему равны Vmax данной реакции и Kм каталазы?

Задача 1.17. Пенициллин гидролизуется и тем самым инактивируется пнициллиназой – ферментом, имеющимся у ряда резистентных бактерий. Молекулярная масса пенициллиназы из Staphylococcus aureus составляет 29,6 кДа. Измеряли количество пенициллина, гидролизуемого в 12 мл раствора в течение 1 мин в присутствии 10^-9 г очищенной пенициллиназы как функцию концентрации пенициллина (табл. 1.17). Примем, что в ходе определения концентрация пенициллина практически не менялась.

Таблица 1.17

[Пенициллин], М	Количество гидролизовавшегося пенициллина, моль
0,1*10-5	0,11*10-9
0,3*10-5	0,25*10-9
0,5*10-5	0,34*10-9
1,0*10-5	0,45*10-9
3,0*10-5	0,58*10-9
5,0*10-5	0,61*10-9

А) Постройте по этим данным график в координатах 1/V против 1/[S]. Подчиняется ли пенициллиназа кинетике Михаэлиса-Ментен? Если да, то чему равна Км?

Б) Чему равна Vmax?

В) Каково число оборотов пенициллиназы в этих экспериментальных условиях? Примем, что на одну молекулу фермента приходится один активный центр.

Задача 1.18. При исследовании кинетики ферментативной реакции были получены следующие данные (табл. 1.18):

Таблица 1.18

[S]10-5, М	v, мкмоль/мин
0,3	10,4
0,5	14,5
1,0	22,5
3,0	33,8
9,0	40,5

Определить К_м и V_max методом Лайнуивера-Берка.

Задача 1.19. Найдите с помощью трех методов линеаризации величины V_max, K_m, k₊₂, исходя из данных табл. 1.19, приведенных в таблице. Концентрация фермента 1,0 10^-9 М.

Таблица 1.19

[S], моль/л	v0, моль/(л мин)
1,0 10-4 2,0 10-4 4,0 10-4 6,0 10-4 1,0 10-3 1,5 10-3 2,0 10-3	6,70 10-6 1,10 10-5 1,70 10-5 2,00 10-5 2,40 10-5 2,65 10-5 2,80 10-5

Задача 1.20. Известно, что D-серингидратаза из Neurospora crassa использует в качестве кофермента пиридоксаль-5-фосфат. Фермент катализирует реакцию

СН₂ОН-СНNH₂-COOH → СН₃-СО-СООН + NН₃

При изучении кинетики данного процесса были получены следующие данные (табл. 1.20):

Таблица 1.20

Концентрация кофермента, 10-5 М	Скорость образования пирувата, мкмоль/20 мин	Концентрация кофермента, 10-5 М	Скорость образования пирувата, мкмоль/20 мин
0,2	0,150	1,70	0,340
0,4	0,200	2,00	0,350
0,85	0,275	8,00	0,360
1,25	0,315

Используйте эти данные для определения константы Михаэлиса сериндегидратазы по отношению к пиридоксальфосфату.

Задача 1.21. Исследовали кинетику окисления L-лактата лактатдегидрогеназой в водно-солевых экстрактах двух органов (печени и сердца), взятых у одного животного. Перед опытами тканевые экстракты диализовали против воды.

В 1см кювету спектрофотометра добавляли 0,5 мл экстракта, 0,3 мл 10 мМ раствора NAD⁺, 0,2 мл 30 мМ раствора семикарбазида и 1,0 мл натрий-фосфатного буфера, рН 7,6. Затем в кювету добавляли 100 мкМ раствор L-лактат натрия в количествах, указанных в таб. 21, и водой доводили объем пробы в каждой кювете до 3 мл. После добавления лактата содержимое кюветы тщательно перемешивали и измеряли через каждые 30 с оптическую плотность пробы на спектрофотометре при длине волны 340 нм. Полученные данные приведены в табл. 1.21.

Таблица 1.21

Время. мин	Оптическая плотность при 340 нм
	Объем добавленного L-лактата, мл 100 мМ раствора
	0,2	0,25	0,5	1,0	0,2	0,25	0,5	1,0
	Экстракт печени				Экстракт сердца
0	0,016	0,012	0,023	0,031	0,013	0,030	0,023	0,015
0,5	0,050	0,052	0,080	0,105	0,052	0,074	0,082	0,084
1,0	0,084	0,092	0,137	0,174	0,090	0,119	0,137	0,155
1,5	0,117	0,131	0,208	0,252	0,127	0,162	0,196	0,222
2,0	0,149	0,169	0,249	0,328	0,163	0,204	0,258	0,290
2,5	0,180	0,207	0,305	0,397	0,199	0,245	0,315	0,350

Необходимо: 1) построить кинетические кривые реакции (графики зависимости оптической плотности от времени), провести касательные к начальным участкам кривых и определить начальную скорость реакции, катализируемой ЛДГ; 2) используя полученные значения начальных скоростей, построить графики зависимости v₀ от [S]; 3) линеаризовать графики v₀ от [S] для определения величин К_м и V_max; сравнить кинетические характеристики ЛДГ в экстрактах печени и сердца, дать обоснование полученным данным.

Задача 1.22. Гомогенат сердца кролика, содержащий малатдегидрогеназу, способен окислять в присутствии NAD⁺ cледующие субстраты: L-малат, мезотартрат и DL-оксибутират.

А. Окисление малата. В 4-см спектрофотометрическую кювету добавляли 4 мл 0,3 М глицинового буфера, рН 10, и 0, 4 мл 50 мМ раствора NAD⁺. Затем в кювету добавляли различные объемы 5 мМ раствора L-малата натрия и общий объем пробы доводили водой до 11,9 мл. Реакция начинали добавлением 0,1 мл разбавленного в 10 раз экстракта сердечной мышцы и измеряли оптическую плотность при 340 нм через каждые 30 с в течение 3 мин. Полученные результаты приведены в табл. 1.22А.

Таблица 1.22А

Время, мин	Оптическая плотность при 340 нм
	Объем добавленного 5 мМ раствора L-ьалата, мл
	2,4	1,2	0,72	0,48	0,24	0,12
0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0	0,085 0,162 0,236 0,310 0,385 0,458	0,060 0,123 0,184 0,245 0,395 9,367	0,070 0,120 9,169 0,220 0,269 0,319	0,048 0,086 0,123 0,160 0,199 0,236	0,027 0,051 0,074 0,099 0,122 0,145	0,019 0,033 0,046 0,061 0,074 0,087

Б. Окисление мезотартрата. Условия опыта для изучения окисления трантрата были такими же, как и в случае малата, но вследствие того, что скорость реакции в этом случае была значительно меньше, использовали большие количества экстракта. Все добавки были такими же, как и при изучении окисления малата, за исключениями: 1) были изменены концентрации субстрата (указаны в табл. 1.22Б) и 2) объем пробы доводили водой до 11,5 мл и реакцию начинали добавлением 0,5 мл неразбавленного экстракта. Полученные данные приведены в табл.22.2

Таблица 1.22Б

Время, мин	Оптическая плотность при 340 нм
	Объем добавленного 10 мМ раствора мезотартрата, мл
	2,4	1,2	0,6	0,36	0,28	0,18
0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0	0,034 0,068 0,100 0,133 0,166 0,198	0,029 0,054 0,078 0,102 0,127 9,152	0,024 0,040 9,057 0,073 0,090 0,106	0,012 0,023 0,035 0,046 0,056 0,067	0,008 0,018 0,027 0,036 0,045 0,055	0,008 0,015 0,022 0,028 0,035 0,042

В. Окисление DL-оксибутирата. Этот субстрат окисляется со скоростью, промежуточной между скоростями окисления малата и мезотартрата. Поэтому при измерении скорости реакции брали разные объемы субстрата (указаны в таблтице), конечный объем пробы доводили водой до 11, 9 мл и реакцию начинали добавлением 0,1 мл неразбавленного экстракта. Полученные данные приведены в табл. 1.22В

Таблица 1.22В

Время, мин	Оптическая плотность при 340 нм
	Объем добавленного 50 мМ раствора оксибутирата, мл
	2,4	1,2	0,72	0,48	0,36	0,24
0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0	0,068 0,117 0,164 0,213 0,259 0,307	0,055 0,094 0,130 0,170 0,208 9,244	0,040 0,069 9,098 0,127 0,156 0,184	0,030 0,054 0,077 0,101 0,125 0,148	0,021 0,040 0,060 0,079 0,099 0,119	0,019 0,034 0,048 0,063 0,078 0,093

Задача 1.23. При действии фосфодиэстеразы на ее субстрат были получены данные, приведенные в табл. 1.23.

Таблица 1.23

[S], 10-3 М	Начальная скорость, мкмоль/мин	[S], 10-3 М	Начальная скорость, мкмоль/мин
2,50	0,0212	0,66	0,0148
1,66	0,0198	0,50	0,0137
1,00	0,0176	0,40	0,0117

Определите величины Кm и Vmax.