1. Кислотно-основной катализ

Концепция кислотно-основного катализа объясняет ферментативную активность участием в химической реакции кислотных групп (доноры протонов) и/или основных групп (акцепторы протонов). Кислотно-основной катализ - часто встречающееся явление. Аминокислотные остатки, входящие в состав активного центра, имеют функциональные группы, проявляющие свойства как кислот, так и оснований.

К аминокислотам, участвующим в кислотно-основном катализе, в первую очередь относят Цис, Тир, Сер, Лиз, Глу, Асп и Гис. Радикалы этих аминокислот в протонированной форме - кислоты (доноры протона), в депротонированной - основания (акцепторы протона). Благодаря этому свойству функциональных групп активного центра ферменты становятся уникальными биологическими катализаторами, в отличие от небиологических катализаторов, способных проявлять либо кислотные, либо основные свойства.

Примером кислотно-основного катализа, в которм кофакторами являются ионы Zn²⁺, а в качестве кофермента используется молекула NAD⁺, можно привести фермент алкогольдегидрогеназу печени, катализирующую реакцию окисления спирта (рис. 2-13):

С₂Н₅ОН + NAD⁺ → СН₃-СОН + NADH + H⁺

2. Ковалентный катализ

Ковалентный катализ основан на атаке нук-леофильных (отрицательно заряженных) или электрофильных (положительно заряженных) групп активного центра фермента молекулами субстрата с формированием ковалентной связи между субстратом и коферментом или функциональной группой аминокислотного остатка (как правило, одной) активного центра фермента.

Действие сериновых протеаз, таких как трипсин, химотрипсин и тромбин, - пример механизма ковалентного катализа, когда ковалентная связь образуется между субстратом и аминокислотным остатком серина активного центра фермента. Термин "сериновые протеазы" связан с тем, что аминокислотный остаток серина входит в состав активного центра всех этих ферментов и участвует непосредственно в катализе. Рассмотрим механизм ковалентного катализа на примере хи-мотрипсина, осуществляющего гидролиз пептидных связей при переваривании белков в двенадцатиперстной кишке (см. раздел 9). Субстратами химотрипсина служат пептиды, содержащие аминокислоты с ароматическими и циклическими гидрофобными радикалами (Фен, Тир, Три), что указывает на участие гидрофобных сил в формировании фермент-субстратного комплекса. Механизм ковалентного катализа химотрипсина рассмотрен на рис. 2-14.

Рис. 2-13. Механизм кислотно-основного катализа на примере алкогольдегидрогеназы печени. I - молекула этилового спирта имеет центр связывания, обеспечивающий гидрофобное взаимодействие активного центра и метильной группы спирта; II - положительно заряженный атом цинка способствует отщеплению протона от спиртовой группы этанола с образованием отрицательно заряженного атома кислорода. Отрицательный заряд перераспределяется между атомом кислорода и соседним атомом водорода, который затем в виде гидритиона переносится на четвёртый углеродный атом никотинамида кофермента NAD+; III - в результате формируется восстановленная форма NADH и уксусный альдегид.

Рис. 2-14. Механизм ковалентного катализа в активном центре химотрипсина.

Радикалы Асп₁₀₂, Гис₅₇ и Сер₁₉₅ участвуют непосредственно в акте катализа. Вследствие нуклеофильной атаки пептидной связи субстрата происходит разрыв этой связи с образованием ковалентно-модифицированного серина - ацил-химотрипсина. Другой пептидный фрагмент высвобождается в результате разрыва водородной связи между пептидным фрагментом и Гис₅₇активного центра химотрипсина. Заключительный этап гидролиза пептидной связи белков - деацилирование химотрипсина в присутствии молекулы воды с высвобождением второго фрагмента гидролизуемого белка и исходной формы фермента.

При проведении ферментативной реакции в условиях избытка субстрата скорость реакции будет зависеть от концентрации фермента. Графическая зависимость такой реакции имеет вид прямой линии (рис. 2-16). Однако количество фермента часто невозможно определить в абсолютных величинах, поэтому на практике пользуются условными величинами, характеризующими активность фермента: одна международная единица активности (ME) соответствует такому количеству фермента, которое катализирует превращение 1 мкмоль субстрата за 1 мин при оптимальных условиях проведения ферментативной реакции. Оптимальные условия индивидуальны для каждого фермента и зависят от температуры среды, рН раствора, при отсутствии активаторов и ингибиторов.

Количество единиц активности nME определяют по формуле:

В 1973 г. была принята новая единица активности ферментов: 1 катал (кат), соответствующий такому количеству катализатора, которое превращает 1 моль субстрата за 1 с. Количество каталов определяют по формуле:

Количество превращённого субстрата (моль)

Время (с)

n катал = 

 

Международная единица ферментативной активности ME связана с каталом следующими равенствами:

1 кат = 1 моль S/c = 60 моль S/мин = 60х10⁶ мкмоль/мин = 6х10⁷ ME,

1 ME = 1 мкмоль/мин = 1/60 мкмоль/с = 1/60 мккат = 16,67 нкат.

В медицинской и фармацевтической практике для оценки активности ферментов часто используют международные единицы активности - ME. Для оценки количества молекул фермента среди других белков данной ткани определяют удельную активность (уд. ак.) фермента, численно равную количеству единиц активности фермента (пМЕ) в образце ткани, делённому на массу (мг) белка в этой ткани:

Уд. ак. = 

Количество превращённого субстрата (мкмоль)

Время (мин) × Количество белка (мг)

 

По удельной активности судят об очистке фермента: чем меньше посторонних белков, тем выше удельная активность.

Если концентрацию ферментов оставить постоянной, изменяя только количество субстрата, то график скорости ферментативной реакции описывают гиперболой (рис. 2-19).

При увеличении количества субстрата начальная скорость возрастает. Когда фермент становится полностью насыщенным субстратом, т.е. происходит максимально возможное при данной концентрации фермента формирование фермент-субстратного комплекса, наблюдают наибольшую скорость образования продукта. Дальнейшее повышение концентрации субстрата не приводит к увеличению образования продукта, т.е. скорость реакции не возрастает. Данное состояние соответствует максимальной скорости реакции V_max.

Таким образом, концентрация фермента - лимитирующий фактор в образовании продукта. Это наблюдение легло в основу ферментативной кинетики, разработанной учёными Л. Михаэлисом и М. Ментен в 1913 г.

Ферментативный процесс можно выразить следующим уравнением:

где k₁ - константа скорости образования фермент-субстратного комплекса; k_-1 - константа скорости обратной реакции, распада фермент-субстратного комплекса; k₂ - константа скорости образования продукта реакции.

Следующее соотношение констант скоростей (k_-1 + k₂)/k₁ называют константой Михаэлиса и обозначают К_m.

Скорость реакции пропорциональна концентрации фермент-субстратного комплекса ES, a скорость образования ES зависит от концентрации субстрата и концентрации свободного фермента. На концентрацию ES влияет скорость формирования и распада ES.

Наибольшая скорость реакции наблюдается в том случае, когда все молекулы фермента находятся в комплексе с субстратом, т.е. в фермент-субстратном комплексе ES, т.е. [Е] = [ES].

Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата выражается следующим уравнением (математическое выведение этой формулы можно найти в пособиях по ферментативной кинетике):

V = 

Vmax[S]

Km + [S]

 

Это уравнение получило название уравнения Михаэлиса-Ментен.

В случае, когда скорость реакции равна половине максимальной, K_m = [S] (рис. 2-19). Таким образом, константа Михаэлиса численно равна концентрации субстрата, при которой достигается половина максимальной скорости.

Уравнение Михаэлиса-Ментен - основное уравнение ферментативной кинетики, описывающее зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата.

Если концентрация субстрата значительно больше K_m (S >> K_m), to увеличение концентрации субстрата на величину К_m практически не влияет на сумму (K_m + S) и её можно считать равной концентрации субстрата. Следовательно, скорость реакции становится равной максимальной скорости: V = V_max. В этих условиях реакция имеет нулевой порядок, т.е. не зависит от концентрации субстрата. Можно сделать вывод, что V_max - величина постоянная для данной концентрации фермента, не зависящая от концентрации субстрата.

Если концентрация субстрата значительно меньше K_m(S << K_m), то сумма (K_m + S) примерно равна К_m, следовательно, V = V_max[S]/K_m, т.е. в данном случае скорость реакции прямо пропорциональна концентрации субстрата (реакция имеет первый порядок).

Рис. 2-19. Зависимость скорости реакции (V) от концентрации субстрата S. V_max - максимальная скорость реакции при данной концентрации фермента в оптимальных условиях проведения реакции. К_m - константа Михаэлиса.

V_mах и K_m - кинетические характеристики эффективности фермента.

• V_max дает характеристику каталитической активности фермента и имеет размерность скорости ферментативной реакции моль/л, т.е. определяет максимальную возможность образования продукта при данной концентрации фермента и в условиях избытка субстрата. К_m характеризует сродство данного фермента к данному субстрату и является величиной постоянной, не зависящей от концентрации фермента. Чем меньше

• К_m, тем больше сродство фермента к данному субстрату, тем выше начальная скорость реакции и наоборот, чем больше К_m, тем меньше начальная скорость реакции, тем меньше сродство фермента к субстрату.

На рис. 2-20 представлена зависимость скорости двух ферментативных реакций (1 и 2) от концентрации субстрата. Константа Михаэлиса первого фермента меньше константы Михаэлиса второго фермента (K_ml < K_m2). Следовательно, сродство первого фермента к субстрату выше, чем у второго фермента, и начальная скорость реакции, катализируемой первым ферментом, выше в сравнении со вторым ферментом.

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ЭФФЕКТЫ ФЕРМЕНТАТИВНОГО ДЕЙСТВИЯ.

1. Эффект концентрации. Поэтому основная роль ферментов заключается в притяжении молекул реагирующих веществ на свою поверхность и концентрация этих молекул в области активного центра фермента.

2. Эффект, сближения и ориентации. Контактные участки активного центра фермента связывают специфически молекулы субстрата, сближают их и обеспечивают ориентацию так, чтобы это было выгодно для действия каталитических групп фермента.

3. Эффект натяжения ("дыбы"). До присоединения субстрата к активному центру фермента его молекула в расслабленном состоянии. После связывания молекула субстрата растягивается и принимает напряжённую деформированную конфигурацию. Понижается Е активации.

4. Кислотно-основной катализ. Группы кислотного типа отщепляют Н+ и имеют отрицательный заряд. Группы основного типа присоединяют Н+ и имеют положительный заряд. Это приводит к понижению энергии активации.

5.Эффект индуцированного соответствия. Он объясняет специфичность действия ферментов. По этому поводу имеется 2 точки зрения: А). Гипотеза ФИШЕРА. Согласно ей имеется строгое СТЕРИЧЕСКОЕ соответствие субстрата и активного центра фермента. В). Теория индуцированного соответствия КОШЛЕНДА. Согласно ей молекула фермента - это гибкая структура. После связывания фермента с субстратом, изменяется КОНФОРМАЦИЯактивного центра фермента и всей молекулы субстрата. Они находятся в состоянии индуцированного соответствия. Это происходит в момент взаимодействия.

Ингибирование ферментов. Конкурентное и неконкурентное ингибирование, примеры реакций. Лекарственные вещества как ингибиторы ферментов.

ИНГИБИТОРЫ. Ферменты - это катализаторы с регулируемой активностью. Ею можно управлять с помощью различных веществ. Действие фермента можно ИНГИБИРОВАТЬ определёнными химическими веществами- ИНГИБИТОРАМИ. По характеру действия ингибиторы делятся на 2 большие группы:

1.Обратимые - это соединения, которые НЕКОВАЛЕНТНО взаимодействуют с ферментом, при этом образуется комплекс, способный к диссоциации.

2.Необратимые - это соединения, которые могут специфически связывать определенные функциональные группы активного центра фермента. Они образуют с ним прочные КОВАЛЕНТНЫЕ связи, поэтому такой комплекс трудно разрушить.

ВИДЫ ИНГИБИРОВАНИЯ. По механизму действия выделяют следующие виды ИНГИБИРОВАНИЯ:

1. Конкурентное ингибирование - торможение ферментативной реакции, вызванное действием ингибиторов, структура которого очень близка к структуре S, поэтому и S, и ингибитор конкурируют за АЦ Ф. и связывается с ним то соединение. концентрация которого в окружающей среде больше. E+S — ES—EP

Многие лекарственные препараты действуют по типу конкурентного ингибитора. Примером является применение СУЛЬФАНИЛА (СА). При различных инфекционных заболеваниях, которые вызываются бактериями, применяются СА препараты. Введение СА приводит к ИНГИБИРОВАНИЮ фермента бактерий, которые синтезируют ФОЛИЕВУЮ кислоту. Нарушение синтеза этой кислоты проводит к нарушению роста микроорганизмов и их гибели.

2.НЕКОНКУРЕНТНОЕ ИНГИБИРОВАНИЕ -ингибитор и субстрат не имеют структурного сходства; ингибитор не влияет на образование F-S-комплекса; образуется тройной ESI -комплекс.

Такие ингибиторы влияют на каталитическое превращение субстрата. Они могут связываются как непосредственно с каталитическими группами AЦ Ф, так и вне АЦ Ф. Но в любом случае они влияют на конформацию активного центра. В качестве неконкурентного ингибитора выступают ЦИАНИДЫ. Они прочно связываются с ионами железа ЦИТОХРОМОКСИДАЗЫ. Этот фермент является одним из компонентов дыхательной цепи. Блокирование дыхательной цепи приводит к мгновенной гибели организме. Действие можно снять только с помощью РЕАКТИВАТОРОВ.

3.СУБСТРАТНОЕ ИНГИБИРОВАНИЕ - это торможение ферментативной реакции, вызванное избытком субстрата. При этом образуется F-S комплекс, но он не подвергается каталитическим превращениям, т.к. делает молекулу фермента неактивной. Действие субстратного ингибитора снимается путём уменьшения концентрации субстрата.

4.АЛЛОСТЕРИЧЕСКОЕ ИНГИБИРОВАНИЕ. АЛЛОСТЕРИЧЕСКИЕ ферменты могут иметь 2 и более единиц протомеров. При этом одна имеет каталитический центр и называется каталитической, а другая - АЛЛОСТЕРИЧЕСКИЙ центр и называется регуляторной. В отсутствии АЛЛОСТЕРИЧЕСКОГО ИНГИБИТОРА субстрат присоединяется к каталитическому центру, и идёт обычная каталитическая реакция. При появлении АЛЛОСТЕРИЧЕСКОГО ИНГИБИТОРА, он присоединяется к регуляторной единице и изменяет КОНФОРМАЦИЮ центра фермента, в результате этого активность фермента снижается.

Номенклатура и классификация ферментов. Характеристика класса оксидоредуктаз. Примеры реакций с участием оксидоредуктаз

1. ОКСИДОРЕДУКТАЗЫ.

2. ТРАНСФЕРАЗЫ.

3. ГИДРОЛАЗЫ.

4. ЛИАЗЫ.

5. ИЗОМЕРАЗЫ.

6. ЛИГАЗЫ.

Каждый класс делится на подклассы. Подклассы делятся на ПОДПОДКЛАССЫ.

1 .ОКСИДОРЕДУКТАЗЫ.

Ферменты этого класса участвуют в ОВР. Это наиболее многочисленный класс ферментов (более 400 ОКСИДОРЕДУКТАЗ). 1.АЭРОБНЫЕ ДЕГИДРОГЕНАЗЫ. Они участвуют в реакциях ДЕГИДРИРОВАНИЯ.

Некоторые АЭРОБНЫЕ ДЕГИДРОГЕНАЗЫ называют ОКСИДАЗАМИ. Например, ОКСИДАЗЫ АК.

2.АНАЭРОБНЫЕ ДГ. Эти ферменты также участвуют в реакциях ДЕГИДРИРОВАНИЯ, т.е. отнятия Н2 от окисляемого субстрата и транспортировка его на любой др. субстрат, кроме О2.

3.ПЕРОКСИДАЗЫ. Ферменты, которые отнимают Н2 от окисляемого субстрата и транспортируют его на ПЕРОКСИД.

4.ЦИТОХРОМЫ. Они содержат в своем составе ГЕМ. ЦИТОХРОМЫ участвуют в транспорте только электронов.

Характеристика класса лиаз, изомераз и лигаз (синтетаз), примеры реакций.

Лиазы. 1 .ДЕКАРБОКСИЛАЗЫ участвуют в реакциях ДЕКАРБКСИЛИРОВАНИЯ.

2.Ферменты, разрывающие связи между атомами углеводов не ГИДРОЛИТИЧЕСКИМ путём без участия воды (АЛЬДОЛАЗА).

3.Ферменты, участвующие в реакциях ГИДРАТАЦИИ и ДЕГИДРАТАЦИИ.

ИЗОМЕРАЗЫ. Ферменты этого класса участвуют в ИЗОМЕРИЧЕСКИХ превращениях. При этом один структурный изомер может превращаться в другой, за счёт внутри молекулярной перегруппировки атомов.

ЛИГАЗЫ. Ферменты этого класса участвуют в реакциях соединения двух и более простых веществ с образованием нового вещества. Эти реакции требуют затрат энергии извне в виде АТФ.

Характеристика классов ферментов трансфераз и гидролаз. Примеры реакций с участием данных ферментов.

ТРАНСФЕРАЗЫ. Ферменты этого класса участвуют в транспорте атомных групп от донора к ацептору. В зависимости от переносимых групп, ТРАНСФЕРАЗЫ делятся на несколько подклассов:

1.АМИНОТРАНСФЕРАЗЫ. Они участвуют в реакциях ПЕРЕАМИНИРОВАНИЯ.

АСАТ - АСПАРАГИНОВАЯ АМИНОТРАНСФЕРАЗА.

2.МЕТИЛТРАНСФЕРАЗЫ (СНЗ группы).

3.ФОСФОТРАНСФЕРАЗЫ (ФОСФАТНЫЕ группировки).

4.АЦИЛТРАНСФЕРАЗЫ (кислотные остатки).

ГИДРОЛАЗЫ. Ферменты этого класса участвуют в реакциях разрыва связей в молекулах субстратов при участии воды.

1.ЭСТЕР АЗЫ действуют на СЛОЖНО-ЭФИРНЫЕ связи. К ним относятся ЛИПАЗЫ, ФОСФОЛИПАЗЫ, ХОЛЕСТЕРАЗЫ.

2.ГЛИКОЗИДАЗЫ - действует на ГЛИКОЗИДНУЮ связь, находящуюся в сложных углеводах. К ним относятся АМИЛАЗА, САХАРАЗА, МАЛЬТАЗА, ГЛИКОЗИДАЗЫ, ЛАКТАЗА.

3.ПЕПТИДАЗЫ участвуют в разрыве ПЕПТИДНЫХ связей в белках. К ним относятся ПЕПСИН, ХИМОТРИПСИН, АМИНОПЕПТИДАЗА, КАРБОКСИПЕПТИДАЗА и т.д.

В основе многих заболеваний лежат нарушения функционирования ферментов в клетке - энзимопатии. Различают первичные (наследственные) и вторичные (приобретённые) энзимопатии. Приобретённые энзимопатии, как и вообще протеинопатии, по-видимому, наблюдают при всех болезнях.

При первичных энзимопатиях дефектные ферменты наследуются, в основном, по аутосомнорецессивному типу. Гетерозиготы, чаще всего, не имеют фенотипических отклонений. Первичные энзимопатии обычно относят к метаболическим болезням, так как происходит нарушение определённых метаболических путей. При этом развитие заболевания может протекать

Рис. 2-34. Активация трипсина частичным протеолизом. Под действием фермента кишечника энтеропептидазы происходит гидролиз пептидной связи Лиз-Иле. В результате отщепления гексапептида с N-конца формируется активный центр в оставшейся части молекулы.

по одному из ниже перечисленных "сценариев". Рассмотрим условную схему метаболического пути:

Вещество А в результате последовательных ферментативных реакций превращается в продукт Р. При наследственной недостаточности какого-либо фермента, например фермента Е3, возможны разные нарушения метаболических путей:

Нарушение образования конечных продуктов. Недостаток конечного продукта этого метаболического пути (Р) (при отсутствии альтернативных путей синтеза) может приводить к развитию клинических симптомов, характерных для данного заболевания:

• Клинические проявления. В качестве примера можно рассмотреть альбинизм. При альбинизме нарушен синтез в меланоцитах пигментов - меланинов. Меланин находится в коже, волосах, радужке, пигментном эпителии сетчатки глаза и влияет на их окраску. При альбинизме наблюдают слабую пигментацию кожи, светлые волосы, красноватый цвет радужки глаза из-за просвечивающих капилляров. Проявление альбинизма связано с недостаточностью фермента тирозингидроксилазы (тирозиназы) - одного из ферментов, катализирующего метаболический путь образования меланинов (см. раздел 9).

Накопление субстратов-предшественников. При недостаточности фермента Е₃ будут накапливаться вещество С, а также во многих случаях и предшествующие соединения. Увеличение субстратов-предшественников дефектного фермента - ведущее звено развития многих заболеваний:

118

Клинические проявления. Известно заболевание алкапгонурия, при котором нарушено окисление гомогентизиновой кислоты в тканях (гомогентизиновая кислота - промежуточный метаболит катаболизма тирозина). У таких больных наблюдают недостаточность фермента окисления гомогентизиновой кислоты - диоксигеназы гомогентизиновой кислоты, приводящей к развитию заболевания. В результате увеличиваются концентрация гомогентизиновой кислоты и выведение её с мочой. В присутствии кислорода гомогентизиновая кислота превращается в соединение чёрного цвета - алкаптон. Поэтому моча таких больных на воздухе окрашивается в чёрный цвет. Алкаптон также образуется и в биологических жидкостях, оседая в тканях, коже, сухожилиях, суставах. При значительных отложениях алкаптона в суставах нарушается их подвижность.

Нарушение образования конечных продуктов и накопление субстратов предшественников.Отмечают заболевания, когда одновременно недостаток продукта и накопление исходного субстрата вызывают клинические проявления.

• Клинические проявления. Например, у людей с болезнью Гирке (гликогеноз I типа) наблюдают снижение концентрации глюкозы в крови (гипогликемия) в перерывах между приёмами пищи. Это связано с нарушением распада гликогена в печени и выходом из неё глюкозы вследствие дефекта фермента глюкозо-6-фосфатфосфатазы (см. раздел 7). Одновременно у таких людей увеличиваются размеры печени (гепатомегалия) вследствие накопления в ней не используемого гликогена.

Ферментные препараты широко используют в медицине. Ферменты в медицинской практике находят применение в качестве диагностических (энзимодиагностика) и терапевтических (энзимотерапия) средств. В этом разделе мы остановимся на основных принципах энзимо-диагностики и энзимотерапии.

Кроме того, ферменты используют в качестве специфических реактивов для определения ряда веществ. Так, глюкозооксидазу применяют для количественного определения глюкозы в моче и крови. Фермент уреазу используют для определения содержания количества мочевины в крови и моче. С помощью различных дегидрогеназ обнаруживают соответствующие субстраты, например пируват, лак-тат, этиловый спирт и др.

А. Энзимодиагностика

Энзимодиагностика заключается в постановке диагноза заболевания (или синдрома) на основе определения активности ферментов в биологических жидкостях человека. Принципы энзимодиагностики основаны на следующих позициях:

• при повреждении клеток в крови или других биологических жидкостях (например, в моче) увеличивается концентрация внутриклеточных ферментов повреждённых клеток;

• количество высвобождаемого фермента достаточно для его обнаружения;

• активность ферментов в биологических жидкостях, обнаруживаемых при повреждении клеток, стабильна в течение достаточно длительного времени И отличается от нормальных значений;

• ряд ферментов имеет преимущественную или абсолютную локализацию в определённых органах (органоспецифичность);

• существуют различия во внутриклеточной локализации ряда ферментов.