Лабораторная диагностика вич-инфекции

При диагностике ВИЧ-инфекции используется 4 группы методов:

1. Определение наличия вируса, его антигенов или копий РНК в материалах от больного или ВИЧ-инфицированного.

2. Серологическая диагностика, основанная на выявлении специфических антител к поверхностным (gp120 и gp41) и внутренним (p18 и p24) белкам ВИЧ.

3. Выявление патогномоничных (специфических) для ВИЧ-инфекции изменений в иммунной системе.

4. Лабораторная диагностика оппортунистических инфекций (СПИД-ассоциированных заболеваний).

1. Вирусологическая диагностика. Материал для выделения ВИЧ — Т-лимфоциты крови, лейкоциты костного мозга, лимфатические узлы, ткани мозга, слюна, сперма, спинномозговая жидкость, плазма крови. Полученным материалом заражают перевиваемую культуру Т-лимфоцитов (H9). Индикацию ВИЧ в культуре клеток проводят по ЦПД (образование симпластов), а также методами иммунофлюоресценции, электронной микроскопии, по выраженной активности обратной транскриптазы. Современные методы исследования позволяют обнаружить один инфицированный лимфоцит на 1000 клеток.

Выявление вирусных антигенов в инфицированных Т-лимфоцитах осуществляют с помощью моноклональных антител.

В последние годы решающее значение для определения прогноза и тяжести ВИЧ-инфекции имеет определение количества копий РНК ВИЧ в плазме крови методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) — так называемая вирусная нагрузка. Если у пациентов, не получающих терапии, вирусная нагрузка находится ниже предела определения (это менее 5000 копий РНК ВИЧ в 1 мл плазмы), это свидетельствует об отсутствии прогрессирования или о медленном прогрессировании заболевания. Степень заразности при этом минимальная. Высокая вирусная нагрузка (более 10⁵ копий РНК/мл) у пациентов с числом CD4-лимфоцитов менее 300 в 1 мкл всегда свидетельствует о прогрессировании болезни.

2. Серологическая диагностика. В настоящее время получила наибольшее распространение.

Материал для исследования — сыворотка крови.

В серологической диагностике ВИЧ-инфекции на первом этапе используют ИФА со стандартными иммуноферментными диагностическими системами. Метод скрининговый. Принцип метода основан на классическом варианте прямого ИФА. Иммуносорбентом для антигенов ВИЧ являются полистироловые планшеты. В лунки планшет вносят испытуемую сыворотку в разведении и проводят инкубацию. После связывания АГ с АТ планшеты трехкратно отмывают от несвязавшихся белков. После этого в лунки планшет вносят конъюгат — антитела к иммуноглобулинам человека, меченные ферментом. Образование специфического комплекса АГ+АТ выявляют внесением субстрата для фермента (раствор ортофенилендиамина и перекиси водорода). В результате воздействия фермента на субстрат меняется окраска среды пропорционально количеству выявленных в пробе антител. Результаты исследования учитывают на фотометре. Наличие вирусспецифических антител в сыворотке крови в дальнейшем необходимо подтвердить посредством исследования методом иммунного блоттинга.

Иммунный блоттинг — подтверждающий тест, позволяющий выявить и дифференцировать наличие антител к различным белкам ВИЧ. В его основе лежит разделение белков ВИЧ по молекулярной массе методом электрофореза в полиакриламидном геле. В последующем антигены ВИЧ переносят на мембрану из нитроцеллюлозы. Затем нитроцеллюлозные мембраны с антигенами ВИЧ обрабатывают испытуемой сывороткой. При этом вирусспецифические антитела образуют комплекс с конкретным АГ (gp120, gp41, p24, p18). Заключительный этап исследования — выявление комплексов антиген-антитело с различными белками ВИЧ. Для этого в систему добавляют конъюгат — антитела против белков человека, меченные ферментом или радиоизотопной меткой. При этом в местах образования иммунных комплексов фиксируется метка. Таким образом, в сыворотке пациента выявляют (либо не выявляют) вирусспецифические антитела ко всем или к нескольким антигенам ВИЧ.

3. Оценка иммунного статуса. Исследование направлено на выявление:

1. соотношения CD4/CD8 клеток (в норме =2 и >, при СПИДе — 0,5 и <);

2. содержания CD4 клеток (<200 клеток/мл.);

3. наличия лейкопении, тромбоцитопении, лимфопении;

4. повышения концентрации Ig A, Ig G и ЦИК в сыворотке крови;

5. снижения пролиферативного ответа лимфоцитов на Т-клеточные митогены;

6. отсутствия кожной реакции ГЗТ на несколько анамнестических антигенов (состояния анергии).