Определение действия фактора проникновения по распространению краски в коже кролика

Рис.1.А. Опыт (тушь+фильтрат культуры стафилококка); Б. Контроль (тушь+физраствор)

Рис. 2. Положительная дермонекротическая реакция при внутрикожном введении экзотоксина

Рис. 3. Воспалительная реакция при внутрикожном введении эндотоксина.

З А Н Я Т И Е 15

Дата ______________

Тема: Иммунитет. Физиологические механизмы естественной резистентности.

План занятия:

1. Регистрация результатов опыта по обнаружению гемотоксина.

2. Знакомство с методами обнаружения микробов в организме, техникой взятия и пересылки материала от больного для бактериологического исследования.

3. Вскрытие мыши, зараженной на предыдущем занятии, и исследование ее органов.

4. Фагоцитоз:

а) постановка опыта фагоцитоза;

б) незавершенный фагоцитоз - микроскопия готовых мазков го­нококков в гное от больных.

5. Реакция фагоцитоза. Определение фагоцитарного числа. Опсонофагоцитарная реакция (ОФР). Определение завершенности фагоцитоза.

6. Лизоцим. Действие лизоцима на различные виды бактерий.

Методические указания

I.Макроскопическое изучение культур стафилококков на кровяном МПА. Зарисовать картину гемолиза.

2.Демонстрация инструментария, посуды, разбор правил пе­ресылки материала для исследования в бактериологические лаборато­рии.

Определение гемотоксина (на мпа с кровью)

Золотистый стафилококк	Эпидермальный стафилококк

3.Вскрытие мыши. Инструменты стерилизуются кипячением. Труп мыши фиксируется на лотке с застывшим парафином брюшком кверху и дезинфицируется путем обжигания шерсти и кожи в области предполагаемых разрезов.

Делается продольный разрез кожи от лобка до нижней челюсти, а затем в стороны конечностей. После этого отсепаровывается кожа и изучается состояние подкожной клетчатки, лимфатических узлов, наличие кровоизлияний с помощью пинцета приподнимают слегка брюшную стенку и делают на ней надрез, после чего осторожно, чтобы не повредить кишечника, вскрывают брюшную полость. Изучают состояние внутренних органов брюшной полости, наличие в ней экссудата.

Печень, селезенку, почки стерильным пинцетом извлекают и помещают в стерильную чашку Петри для последующего микроскопического исследования. Далее вскрывается грудная полость, для чего пинцетом приподнимают грудину, рассекают диафрагму и с помощью ножниц отсекают грудину вместе с участком ребер таким образом, чтобы стали доступны легкие и сердце.

Раскаленным пинцетом прижигают стенку сердца (она при этом фиксируется с помощью другого пинцета) и кончиком пастеровской пипетки прокалывают стенку сердца. Отсасывают из сердца кровь и тут же делают посев в МПБ и на косячок МПА. Изучают состояние легких, обращают внимание на наличие экссудата в плевральной и околосердечной полостях. Для выделения чистой культуры возбудителя делается по­сев также из селезенки и печени (если нужно, то из других органов) на МПБ и МПА.

Мазки-отпечатки или препараты-оттиски готовят на одном стекле по определенной схеме:

из печени - № I;

из легких - № 2;

из селезенки - № 3;

из лимфатического узла - №.4;

на конце стекла делают один сплошной мазок из крови сердца.

Приготовить препараты-оттиски из органов мыши: печени, легких, селезенки, лимфатического узла, крови. Окрасить препарат-оттиск по способу Ионэ для обнаружения капсул. Отметить, соответствуют ли об­наруживаемые в препаратах микроорганизмы тем, которые использова­лись для заражения мыши. Составить протокол вскрытия мыши с указанием в нем обнаружен­ных изменений в органах трупа. Сделать необходимые зарисовки.

Протокол вскрытия мыши.

1. Внешний осмотр____________________________________________________

2. Состояние подкожной клетчатки______________________________________

3. Состояние лимфатических узлов______________________________________

4. Грудная полость____________________________________________________

а) легкие___________________________________________________________

б) сердце___________________________________________________________

в) медиастинальные лимфатические узлы_______________________________

5. Брюшная полость___________________________________________________

а) печень_____________________________________________________________

б) селезенка_________________________________________________________

в) почки с надпочечниками____________________________________________

6. Примечание________________________________________________________

4.а) Методика постановки опыта фагоцитоза: белой мыши внутрибрюшинно вводят 1-2 мл стериального МПБ, раздражение которым брюшины приводит к скоплению в брюшной полости большого количества лейкоцитов. Через 4-5 часов в брюшную полость мыши вводят шприцем или пастеровской пипеткой 0,5-1 мл густой взвеси суточной культуры стафилококка. Через 8-10 минут капилляром пастеровской пипетки прокалывают брюшную стенку и из брюшной полости набирают экссудат. Из экссудата готовят препараты-мазки, подсушивают, фиксируют в смеси Никифорова и окрашивают метиленовым синим. При микроскопии в мазке видны бледно-голубые лейкоциты, в их цитоплазме - синие стафилокок­ки.

б) промикроскопировать готовые препараты-мазки гонококков из гнойных выделений больного. Зарисовать картину фагоцитоза микроорга­низмов.

Препарат оттиск из органов мыши; окраска по Ионэ	Фагоцитоз гонококков Окраска____________

5.Реакция фагоцитоза. Постановка опсоно-фагоцитарной реакции.

а) В шприц, объемом в I мл, берут 0,2 мл 3,8%-ного раствора лимоннокислого натрия и отсасывают из краевой вены уха иммунизированного кролика кровь до I мл. После осторожного перемешивания крови с цитратом натрия ее выливают в пробирку и добавляют туда 0,5мл взвеси убитых бактерий. Вновь осторожно перемешивают кровь с бактериями, и пробирку помещают в термостат на 30 минут при 370, после чего готовят препараты-мазки. Для этого хорошо обезжиривают стекло и с помощью пастеровской пипетки осторожно отсасывают слой лейкоцитов, располагающихся в виде сероватой пленки над слоем эритроци­тов.

Каплю взятой взвеси лейкоцитов наносят на стекло и готовят мазок таким же образом, как для определения формулы белой крови. Мазок высушивают на воздухе, фиксируют смесью Никифорова в течение 10 минут и окрашивают синькой Менсона в течение 30 секунд, промы­вают водой, обсушивают и рассматривают с иммерсионным объективом.

Пример вычисления фагоцитарного числа

2	3	0	6	2
4	0	5	4	2
5	0	6	2	1
2	3	4	3	0
4	1	5	2	1

Фагоцитарное число равно

б) Для определения опсоно-фагоцитарного числа под микроскопом ведут подсчет бактерий, поглощенных лейкоцитами. Подсчитывают общее количество бактерии, поглощенных 25 лейкоцитами. Частное от де­ления числа фагоцитированных микробов на 25 является фагоцитарным числом для испытуемой иммунной сыворотки. Таким же образом определяется фагоцитарное число нормальной (неиммунной сыворотки). Отно­шение фагоцитарного числа иммунной сыворотки к фагоцитарному числу нормальной сыворотки называется опсоническим индексом.

Фагоцитарное число в вашем исследовании равно_______________________

в) Методика определения завершенности фагоцитоза. 18-20-часовая агаровая культура бактерий (1 мл около I млрд. клеток) добавляется к исследуемой крови и смесь выдерживается в течение 30- 45 минут в термостате при 37 °С .

После этого готовят мазки для определения фагоцитарной актив­ности (ОФР).

Оставшуюся смесь (несколько капель) наносят на поверхность слабощелочного агара в чашке Петри, равномерно распределяют по площади 5x5 см и чашку помещают на 2 часа в термостат для подращи­вания бактерий.

Через 2 часа готовят препараты-отпечатки. Для этого вырезают из части агара, на которую наносили смесь лейкоциты-микробы, пла­стинку размером 2x4,5 см и помещают ее на предметное стекло той поверхностью, где нанесена смесь. После приготовления отпечатка с помощью пинцета пластинку сбрасывают, но так, чтобы не допустить ее скольжения по стеклу.

Препарат-мазок и препарат-отпечаток фиксируют в смеси Никифорова, окрашивают по Романовскому-Гимза в течение 25-30 минут (краску разводят перед употреблением из расчета 3 капли краски на I мл воды).

Для определения завершенности фагоцитоза в препарате-отпечатке подсчитывают 50 нейтрофилов и определяют процентное соотношение дезинтегрированных (разрушенных) и жизнеспособных клеток среди фагоцитированных микробов в лейкоците.

Погибшие бактерии при этом окрашены в розовый цвет или синий и находятся в разной стадии разрушения. Жизнеспособные клетки-более крупные и окрашены в интенсивно синий цвет.

6.Опыт действия лизоцима наMicrococcus lysodeikticus.

Для опыта необходимо иметь:

1.Раствор яичного белка в разведении 1:25.

2.Культуру M. lysodeikticusна косячке МПА.

3.Физиологический раствор во флаконе.

4.Пипетки емкостью в I и 5 мл.

5.Две агглютинационные пробирки.

Порядок работы

1. Пометить карандашом по стеклу опытную и контрольную пробирки.

2. В контрольную пробирку налить I мл физиологического раствора.

3. В опытную пробирку налить I мл раствора яичного белка в исходном разведении.

4. Приготовить бактериальную взвесь, для чего в пробирку с культурой M. lysodeikticusвнести 5 мл физиологического раствора и, вращая пробирку между ладонями, смыть культуру.

5. В опытную и контрольную пробирки добавить по I мл полученной бактериальной взвеси и поставить пробирки в термостат на 1 час при 37 °С.

6. Через час зарегистрировать результаты опыта, отмечая полное растворение микробов+ + + +, частичное + + и отсутствие лизиса знаком «–».

Регистрация опыта с лизоцимом

Пробирки	Компоненты			Результаты
	Физиологический раствор	Взвесь бактерий	Яичный белок в разведении 1:25
Контроль	1 мл	1 мл	—
Опыт	—	1 мл	1 мл

Контрольные вопросы

Какие правила необходимо соблюдать при взятии и пересылке материала для бактериологического исследования?

Что такое бактериемия?

Что такое септицемия (сепсис)?

Что такое септикопиемия?

В чем заключается подготовка погибшего животного к вскрытию?

Какие условия необходимо соблюдать при вскрытии заразного трупа?

В каком порядке производится вскрытие и исследование трупов животных?

Какой материал чаще всего берется для бактериологического исследования?

Как производится взятие крови из трупа животного?

Как производится взятие материала для посевов из органов трупа животного?

Что такое иммунитет?

Какие виды иммунитета в отношении инфекционных болезней вы знаете?

Каковы анатомо-физиологические механизмы естественной резистентности?

Каковы основные направления в развитии современной иммунологии?

Какие клетки обладают фагоцитарной активностью?

Какое различие между завершенным и незавершенным фагоцитозом?

Из каких фаз состоит фагоцитарный процесс?

Кто является создателем фагоцитарной теории иммунитета?

Как фиксируются препараты-мазки для изучения фагоцитоза?

Что такое бактериотропины и опсонины?

Что такое фагоцитарное число?

Что такое опсонический индекс?

Как определяют фагоцитарное число и опсонический индекс?

Что такое лизоцим, какова его химическая природа?

Где содержится лизоцим в организме человека?

В чем проявляется действие лизоцима на бактерии?

Как ставится опыт для изучения действия лизоцима на бактерии?

Приложение к ЗАНЯТИЮ 15.

Иммунитет- это способ защиты организма от живых тел и веществ, несущих на себе признаки генетически чужеродной информации.

Рис.1. Схема вскрытия животного

З А Н Я Т И Е 16

Дата ______________

Тема: Антигены и антитела. Серологический метод диагностики инфекционных заболеваний. Реакция агглютинации (РА), реакция пассивной гемагглютинации (РПГА). Реакция преципитации (РП). Реакция связывания комплемента (РСК).

План занятия:

1. Антигены. Виды антигенов: корпускулярные, растворимые. Ток­сины, анатоксины. Приготовление антигенов.

2. Антитела. Иммунные сыворотки. Получение иммунных сывороток.

3. Реакции иммунной сыворотки. Реакция агглютинации: а) на стекле;

б) в пробирке.

4. Антигены бактериальной клетки. "0"-,"Н"-, "К"-антигены , их свойства. Приготовление "О" и "Н"-антигенов. Реакция агглютинации на стекле с "О" и "Н"-антигенами.

5. Тканевые антигены. Эритроциты. Реакция агглютинации эритроцитов - гемагглютинация.

6. Понятие о титре агглютинирующей сыворотки. Определение титра агглютинирующей сыворотки, с "Н"-антигеном.

7. Использование классического пробирочного метода реакции агглютинации для:

а) определения титра антител в сыворотке больного (серологический метод диагностики);

б) определения антигенного строения выделенного возбудителя (серологическая идентификация возбудителя в ходе бактериологического исследования).

8. Реакция пассивной гемагглютинации (РПГА), или непрямой гемагглютинаций (НПГА). Варианты использования РПГА.

9. Варианты реакций агглютинации на стекле, которые используют в качестве методов экспресс-диагностики:

а) реакция коагглютинации;

б) реакция латекс-агглютинации;

в) реакция агрегат-гемагглютинации (РАГА) и др.

10. Реакция преципитации. Получение бактериального гаптена и постановка реакции кольцепреципитации.

11. Реакция преципитации в геле (агаре) для определения:

а) природы антигена;

б) природы антител.

12.Реакция лизиса. Гемагглютинация, гемолиз.

13.Реакция связывания комплекса (РСК). Методика постановки РСК. Постановка основного опыта.

Методические указания

1.Приготовить корпускулярные антигены из культур водного вибриона и кишечной палочки. Для этого:

а) каждый студент получает одну пробирку с соответствующей культурой бактерий и проверяет её чистоту макро- и микроскопически; препарат-мазок окрасить по Граму;

б) приготовить взвесь бактерий в физиологическом растворе, стерильной пипеткой добавить в пробирку с культурой 5 мл физиологичес­кого раствора и, вращая пробирку между ладонями, смыть бактерий со среды;

в) с помощью стерильной пипетки перенести взвесь бактерий в стерильную пробирку и прогреть ее для умерщвления бактерий на водяной бане при температуре 70° в течение 30 минут для вибриона и 60 минут для кишечной палочки;

г) установить концентрацию бактерий во взвеси с помощью опти­ческих стандартов, после чего приготовить необходимое разведение антигена.

2.Методы иммунизации животных и получения иммунных сывороток:

а) демонстрация различных способов иммунизации животных: подкожный, внутривенный и внутрибрюшинный способы введения антигенов;

б) демонстрация различных способов получения крови от иммунизированных животных: взятие крови из вен у кролика и у лошадей, взятие крови из сердца у кролика и морской свинки.

3.Реакция агглютинации:

а) ориентировочная реакция на стекле. На чистое предметное стекло пастеровской пипеткой наносят каплю агглютинирующей противовибрионной сыворотки в разведении 1:25 и рядом (другой пипеткой) каплю физиологического раствора (контроль антигена). В ту и другую каплю пастеровской пипеткой добавляют по 1-2 капли взвеси вибриона. Осторожно перемешивают петлей антиген вначале с физиологическим раствором, а затем с иммунной сывороткой (но не наоборот!). Чтобы ускорить наступление реакции агглютинации, предметное стекло, на котором производится опыт, рекомендуется слегка покачивать и очень осторожно подогревать высоко над пламенем спиртовки. Наблюдают за агглютинацией невооруженным глазом или пользуясь лупой. Реакция агглютинации более отчетливо видна, если смотреть на каплю снизу вверх. Феномен агглютинации проявляется образованием взвешенных хлопьев и просветлением жидкости в капле с сывороткой. В контроль ной капле (физиологический раствор) жидкость сохраняет свою равномерную гомогенную мутность;

б) реакция агглютинации в пробирке. В опыт берут две пробирки, специально используемые для реакции агглютинации. В одну из них добавляют 0,5 мл агглютинирующей сыворотки в разведении 1:25 (опыт), а в другую - 0,5 мл физиологического раствора (контроль антигена). Затем в обе пробирки добавляют по 0,5 мл соответствующего антигена, содержащего в I мл I млрд микробных тел. После перемешивания пробирки помещают в термостат на 2 часа при температуре 37⁰, после чего учитывают результат.

Реакция агглютинации на стекле: 1 – опыт; 2 – контроль

Вибрион Окраска по Граму

В опытной пробирке жидкость станет прозрачной (или почти прозрачной), а на дне пробирки выпадает осадок, который при встряхивании пробирки разбивается на свободно плавающие в жидкости хлопья. В контрольной пробирке жидкость сохранит равномерную и гомогенную мутность. При более длительном хранении пробирок (24 часа) в контрольной пробирке также может образоваться осадок, однако при встряхивании пробирок он разрушается и жидкость становится равномерно мутной.

Реакция агглютинации в пробирках: 1 – опыт; 2– контроль

4.Разбор методов приготовления 0- и Н-антигенов.

Реакция агглютинации на стекле с 0- и Н-антигенами. На чистое хорошо обезжиренное предметное стекло с помощью пастеровской пипетки наносят две капли сыворотки, содержащей 0- и Н-антитела. В одну аз них добавляют каплю антигена 0, в другую - каплю антигена Н. Антигены перемешивают с сыворотками (пользоваться разными петлями, или петлю прокаливать после перемешивания одной капли!). В капле, в которую был добавлен 0-антиген, образуется мелкозернистый осадок агглютинат, а в капле с Н-антигеном - крупнохлопчатый агглютинат.

5.Реакция гемагглютинации. На чистое стекло наносят пасте­ровской пипеткой каплю агглютинирующей сыворотки (полученной при иммунизации кроликов бараньими эритроцитами), рядом - другой пипеткой - каплю физиологического раствора. Затем в обе капли добавляют по одной капле 4 %-ной взвеси эритроцитов барана (не касаться пипеткой капли сыворотки!). С помощью бактериальной петли перемеши­вают добавленные эритроциты сначала с физиологическим раствором, а затем с сывороткой (но не наоборот!). Реакция склеивания эритроцитов (гемагглютинация) происходит только в опытной капле. Она наступает быстрее при покачивании стекла и осторожном подогревании.

В контрольной капле склеивания эритроцитов не происходит, так как там отсутствуют антитела.

Реакция агглютинации: 1 – О-агглютинация. 2 – Н-агглютинация.

Гемагглютинация: 1- Опыт. 2- Контроль.

6.Определение титра агглютинирующей сыворотки. Для опыта необходимо иметь:

а) агглютинирующую сыворотку против водного вибриона в исход­ном разведении 1:25;

б) взвесь убитых вибрионов (диагностикум: содержащий в I мл I млрд микробных тел);

в) физиологический раствор;

г) две пипетки емкостью I мл и 5 мл ;

д) штатив с набором из 8 агглютинационных пробирок.

Порядок работы

1) пронумеровать все пробирки;

2) разлить по 0,5 мл физиологического раствора во все пробирки, за исключением первой;

3) налить в первую и во вторую пробирки по 0,5 мл сыворотки в разведении 1:25;

4) перемешать сыворотку с физиологическим раствором во второй пробирке и перенести пипеткой (емкостью I мл) 0,5 мл в третью про бирку, после перемешивания 0,5 мл разведенной сыворотки переносится таким же образом из третьей пробирки в четвертую, из четвертой в пятую и т.д. до седьмой пробирки, из седьмой пробирки 0,5 мл жидкости удаляется. В восьмой пробирке сыворотки не должно быть. Она служит контролем антигена. После такого разведения сыворотки во все пробирки, но уже другой пипеткой, добавляют антиген по 0,5 мл. Пробирки энергично встряхивают вместе со штативом (для перемешивания антигена с антителом) и помещают в термостат при 37⁰ на 2 часа, после чего читают предварительный результат. Окончательный результат опыта регистрируют через 24 часа.