Антибиотики

Антибиотики, их продуценты.

Классификация антибиотиков по происхождению и механизму действия

Термин "антибиотик" был введён З. А. Ваксманом в 1942 году. По определению антибиотики - это антимикробные вещества как правило, природного происхождения и продукты их химической модификации, подавляющие и угнетающие в ничтожно малых концентрациях рост и развитие простейших, микроорганизмов, низших грибов, вирусок и клеток злокачественных опухолей. К антимикробным средствам относят антисептики, дезинфектанты и химиотерапевтические вещества.

Антисептики - это химические вещества, неизбирательно и губительно действующие на микроорганизмы (в том числе - патогенные), находящиеся на поверхности тела и слизистых оболочек открытых полостей.

Дезинфектанты - это, в основном, антисептики, действие которых направлено на патогенные микроорганизмы, находящиеся на (в) объектах внешней среды.

Химиотерапевтаческие средства - это вещества синтетического и природного происхождения, избирательно и губительно действующие на патогенные микробы, клетки злокачественных опухолей и гельминты.

Антисептики, дезинфектанты, неорганические и синтетические химиотерапевтические средства не имеют непосредственного отношения к биотехнологии. В то же время подавляющее большинство антибиотиков получают при ферментации микробов-продуцентов, или, в других случаях, применяют антибиотическое ядро для синтеза целевого продукта - полусинтетического антибиотика. Известны единичные антибиотики, которые в настоящее время производят на предприятиях органического синтеза (левомицетин и некоторые другие).

Таким образом, определение понятия "антибиотики" теперь относят к веществам природного, полусинтетического и, реже, синтетического происхождения, которые в малых концентрациях ингибируют рост и размножение каких-либо микроорганизмов. Продуцентами одних антибиотиков (например, бацитрацина , полимиксина и др.), являются бациллы, других - актиномицеты (например, актиномицинов, гентамицинов, канамицинов), третьих - нитчатые грибы (например, гризеофульвина, пенициллинов, цефалоспоринов), четвертых - неспорообразующие бактерии (например, монобактамов).

Антибиотики -лактамы.

Пенициллины. Пенициллин впервые получен в аморфном, а затем - в кристаллическом виде А, Флемингом, X. Флори и Е. Чейном в 1940 г. До сих пор пенициллиновые антибиотики составляют наиважнейшую группу химиотерапевтических средств. Ядром пенициллинов является 6-аминопенициллановая кислота, или 6-АПК, которую используют для получения полусинтетических пенициллинов.

Один водород в аминогруппе 6-АПК может быть заменен на какой-либо радикал (R), усиливающий или расширяющий антимикробный спектр полусинтетического производного. Обычно 6-АПК получают из бензил-пенициллина (пенициллина G).

В настоящее время в различных странах производят биосинтетические (с помощью Penicillium notatum или P.chrysogenum) антибиотики и на их основе - полусинтетические антибиотики --лактамы.

Цефалоспорины- другая обширная группа экстрацеллюлярных р-лактамных антибиотиков, в которых шестичленное дигидротиазиновое кольцо соединено с -лактамным кольцом. Благодаря этому ядром цефалоспоринов является 7-аминоце-фалоспорановая кислота, или 7-АЦК (цефемовое ядро), впервые выделенная в ходе очистки цефалоспорина С .

Известно около 20 цефалоспоринов, созданных методом полусинтеза из АЦК: цефалоридин (цепорин), цефуроксим, цефокситин, цефалотин, цефацетрил, цефалексин, цефазолин, цефаридин, цефотаксим, цефтриаксон, цефтазидим и др.

Боковые цепочки, содержащие 2-аминотиазолил как в цефотаксиме, цефтриаксоне, цефтазидиме и некоторых других, усиливают активность цефалоспоринов против стрептококков и грамотрицателъных бактерий; иминометоксигруппа в той же позиции, например, в цефуроксиме, обеспечивает стабильность антибиотика против плазмидо-опосредованных р-лактамаз, и т. д.

О к с а ц е ф е м ы - сходны с цефалоспоринами, у которых атом серы в дигидротиазиновом (цефемовом) кольце замещен на кислород. Представителем такой группы антибиотиков является широко спектральный латамоксеф (мексалактам), в котором 7-а-метоксигруппа стабилизирует молекулу, как таковую, равно как и придает устойчивость и к большинству -лактамаз.

Клавамы - (3-лактамные антибиотики, отличающиеся от пенициллинов тем, что в тиазолидиновом кольце последних сера заменена на кислород (клавемовое оксазолидиновое кольцо) и в позиции 6 нет боковой цепи. Такой антибиотик -лавулановая кислота изолирована Streptomyces clavuligerus. Она слабо активна против бактерий, но является потенциальным ингибитором стафилококковой лактамазы и р-лактамазы, образуемой грамотрицательными бактериями. Сочетание широкоспектральной клавулановой кислоты с -лактамазочувствительными ампициллином и амоксициллином является основой комбинКарбапенемы - это новое семейство -лактамных антибиотиков, представляющих собой аналоги пенициллинов или клавамов, в которых сера у первых и кислород у вторых замещены на углерод:ированного препарата аугментин.

К этому семейству относятся оливановые кислоты и тиенамицин.. Их продуценты - стрептомицеты. Эти антибиотики обладают широким антимикробным спектром и являются выраженными ингибиторами –лактамаз.

Нокардицины - новая группа [3-лактамных антибиотиков, продуцируемых бактериями из рода Nocardia. Выделены Нокардицины А, В, D, Е, F, G. Наиболее активным из них против грамотрицательных бактерий (но не грамположительных} оказался нокардицин А.

Монобактамы - это моноциклические монобактамные антибиотики, продуцируемые штаммами бактерий, например Pseudomonas acidophila и Gluconobacter species. Их ядром является 3-аминомонобактамовая кислота (3-АМК). Ее можно получить из природных монобактамов или из 6-АПК.

Природным высокоактивным против грамотрицательных бактерий и устойчивым к действию (3-лактамаз оказался азтреонам. Однако он не активен против грамотрицателъного анаэроба Bacteroides fragilis, способного продуцировать -лактамазу, активную против данного антибиотика. Комбинация клавулановой кислоты с монобактамами также неэффективна против этого микроба.

Антибиотики-тетрациклины - это широкоспектральные антибиотики, активные против бактерий; их продуцентами являются стрептомицеты. Некоторые тетрациклины относятся к ряду полу синтетических препаратов.

Антибиотики-гликозиды. Среди них можно выделить структуры, содержащие О-, S- и N-гликозидные связи. К числу первых относят аминогликозидные антибиотики и новобиоцин, ко вторым - клиндамицин и линкомицин, к третьим - некоторые нуклеозидные антибиотики.Антибиотики-О-гликозиды.

Аминогликозиды - содержат аминосахара в своей структуре. Большинство из них (канамицины, гентамицины и др.) продуцируется актиномицетами; тобрамицин - аналог канамицина В (З-дезоксиканамицин В); нетилмицин является полусинтетическим производным сизомицина (N-этилсизомицин).Все антибиотики-аминогликозиды обладают широким спектром действия на различные патогенные бактерии. Продуцентом гентамицинов является Micromonospora purpurea, а сагамицина .

Антибиотики - макролиды - имеют О-гликозидные связи; они продуцируются стрептомицетами и проявляют активность против большинства грамположительных и некоторых грамотрицательных бактерий (Neisseria spp., Haemophilus influenzae и Legionella pneumophila). На практике чаще применяют эритромицин, олеандомицин, триацетилолеандомицин и спирамицин. Они содержат в своей структуре макро циклическое лактонное кольцо, связанное с углеводными остатками, из которых аминосахар всегда располагается ближе к макролактону, чем нейтральный углевод.

Олеандомицин, его эфир - триацетилолеандомицинк спирамицин сходны по спектру антибактериального действия с эритромицином, но несколько слабее его по активности.

Новобиоцин продуцируется культурой Streptoniyces spheroides и другими видами. Антибиотик активен против возбудителей пневмонии, некоторых кишечных и раневых инфекций, ангин и флегмон. По химической структуре - это О-гликозид (амидогликозид), агликон которого существенно массивнее углеводной части.

Оливомицин - О-гликозидный антибиотик, в котором сахаристая часть представлена триаозой и биозой, между которыми как бы вставлен агликоноливин (хромомицинон). Оливомицин является представителем большой группы антибиотиков - аналогов ауреоловой кислоты (митрамицина), активных Против грамположителъных бактерий и отдельных опухолей. Оливомицин продуцируется Streptomyces olivoreticuli.

Дауномицин (рубомицин) - О-гликозидный антибиотик из группы антрациклинов, образуемый Streptomyces species. Углеводный компонент в нем - даунозамин, или 2, 3, 6-тридезокси-З-ами-ноликсоза. Антибиотик обладает противомикробным и противоопухолевым действием. Иммуносупрессивым и противоопухолевым действием обладает О-гликозидный антибиотик блеомицая, содержащий также и пептидные связи. Он образуется стрептомицетом; углеводный компонент в нем представлен амидобиозой.

Ферментационные процессы получения антибиотиков еще не достигли того совершенства, которое могло бы быть обеспечено благодаря компьютерной технике и пониманию физиологии продуцентов. Своеобразным тормозом совершенствования технологии выступают сами клеточные популяции микроорганизмов, которые изменяются качественно и количественно в течение всего продуктивного цикла. Поэтому не удается получать полностью идентичных результатов даже в двух смежных ферментациях, равно как и весь технологический процесс удается сравнительно хорошо проводить лишь в периодическом режиме.

Так как антибиотические вещества являются вторичными метоболитами, то биосинтез их сопряжен с переходом культуры продуцента в идиофазу. Следовательно, здесь целесообразно лимитирование роста продуцента. Таким лимитирующим фактором при биосинтезе пенициллина выступает глюкоза, тогда как при биосинтезе антибиотиков стрептомицетами - фосфаты. Все это важно при компановке питательных сред, подкормке штамма - продуцента в процессе биосинтеза антибиотика. Так, среда для продукции пенициллина (она же пригодна для накопления инокулюма) включает глюкозу - 1,5%, лактозу - 5% (лактоза снимает катаболитную репрессию глюкозы), аммония сульфат и фосфаты - 0,5-1%, кукурузный экстракт - 2-3%, предшественники антибиотика - фенокси- или фенилуксусная кислота - 0,3-0,6%, мел - 0,5-1%, пеногаситель - 0,5-1%; температуру ферментации поддерживают на уровне 22-26?С при рН от 5,0 до 7,5 и аэрации 1 м3 воздуха на 1 м3 среды в I минуту; продолжительность ферментации - 4 суток.

Так называемая "всеядность" актиномицетов обеспечивает им способность расти и продуцировать антибиотики на средах, содержащих белки (соевая мука, рыбная мука, белок клейковины пшеницы и пр.), крахмал. Тем не менее, применительно к каждому продуценту имеются свои особенности, обычно отмечаемые в регламентной документации. Например, посевной материал Streptomyces kanamyceticus получают на соево-крахмальной среде и на ней же проводят основную ферментацию при 27-28?С в течение 4-5 суток при поддержании рН на уровне 7,1-7,6.

При ферментации Str. floridae (продуцент виомицина, или флоримицина) рекомендуют среду, содержащую глюкозу или гидрол, соевую муку, кукурузный экстракт, нитраты, мел; температуру поддерживают в пределах 27-29?С, рН на уровне 7,0-7,3.

В случае ферментации Str. erythreus в питательную среду добавляют пропиловый спирт, как предшественник антибиотика эритромицина.

Продуцент нистатина Str. noursei интенсивно потребляет аммонийный азот (не нитратный), и т. д.Перед выделением антибиотика из культуральной жидкости необходимо отделить твердую, или плотную фазу от жидкой. В этих случаях, как правило, используют фильтрацию. Качество твердой фазы заметно сказывается на эффективности фильтрации. Здесь можно отметить следующую закономерность - нативная бактериальная масса фильтруется хуже мицелиальной. С учетом того факта, что высшие актиномицеты способны формировать нитчатые структуры, то их отделение при фильтрации происходит несколько легче, чем других бактерий.

Пути улучшения фильтрации: обработка ростовых сред электролитами, тепловая коагуляция, добавление фильтрующих наполнителей, кислотная коагуляция и некоторые другие. Трудности выделения антибиотиков обусловлены многокомпонентностью культуральных жидкостей и малой концентрацией в них целевых продуктов. Так, пенициллин может накапливаться примерно до 30 г/л при 8%-м выходе от субстрата. При этом сухие выщества после отделения мицелия обычно составляют порядка 3-6%, из которых лишь 15-30% приходятся на антибиотик. Поэтому любую культуральную среду необходимо обрабатывать так, чтобы антибиотическое вещество переходило в ту фазу, из которой затем он будет наиболее полно выделен. В ряде случаев этого можно добиться подкислением (тетрациклины) или, напротив, подщела-чиванием культуральной жидкости (новобиоцин), добавлением солей, щавелевой кислоты (эритромицин) и т. д., до или после коагуляции и осаждения белков из нативных растворов.

Если для выделения антибиотика применяют ионный обмен, то нативный раствор стремятся освободить от ионов-конкурентов (растворимые оксалаты - для удаления ионов кальция; натрия триполифосфат - для связывания ионов магния; желтая кровяная соль - для комплексования ионов железа).

Антибиотические вещества, накапливающиеся в клеточной биомассе в процессе ферментации микробов-продуцентов, выделяют другими методами, нежели антибиотики, содержащиеся в культуральной жидкости. В первом случае, как правило, необходима экстракция каким-либо растворителем из нативных или дезинтегрированных клеток (система "твердое тело-жидкость").

Примерная схема выделения целевого антимикробного продукта из культуральной жидкости может быть представлена в следующем виде. В приведенную схему должны быть внесены соответствующие коррективы в зависимости от физико-химических характеристик целевого продукта и возможностей аппаратурного оформления процесса. В настоящее время все большее распространение приобретают мембранные методы концентрирования и выделения различных веществ, хотя до сих пор в ряде производств БАБ (включая антибиотики, например, пенициллин) не удалось отказаться от традиционных способов выделения и очистки целевых продуктов (экстракция в системе "жидкость-жидкость", адсорбция на активированных углях, диализ).