VET_5-2004

Фото 5. Артефакт при неправильном высушивании эритроцитов: светопреломляющиеся тела, располагающиеся на поверхности эритроцитов. Активированный лимфоцит.

Фото 6. Артефакт окраски: депо красителя.

Фото 8. Обследование косички мазка крови при слабом увеличении. Возможен подсчет эритроцитов. На данном снимке выраженный лейкоцитоз с преобладанием нейтрофилов.

Фото 7. Макроскопическая агглютинация. Следует обратить внимание на отсутствие однородности крови.

Эта агглютинация вызвана аутоагглютинацией или персистенцией эритроцитарных (монетных) столбиков.

Обнаружение скоплений тромбоцитов (фото 9) свидетельствует об артефакте, который может привести к ложному выводу о тромбоцитопении.

•На уровне моноцеллюлярного слоя полное визуальное исследование предметного стекла при малом увеличении (х40) позволяет подсчитать лейкоцитарную формулу.

•Рекомендуется провести поиск ядерных эритроцитов. Если мы их обнаруживаем в большом количестве, то это свиде- 21 тельствует о нарушении (речь может идти о циркуляции микрофиллярий, или мы имеем дело с аномальными клетками). Исследователь всегда акцентирует свое внимание на предполагаемом наличии макроскопической агглютинации эритроцитов (фото 10) или формировании монетных столбиков (фото 11).

•Затем исследование различных клеток проводят под большим увеличением.

ОЦЕНКА СОСТОЯНИЯ ЭРИТРОЦИТОВ

•Оценку состояния эритроцитов проводят под иммерсией (х100) в средней части мазка: в моноцеллюлярном слое, где они хорошо разделены и не деформированы.

•При морфологической оценке выявляют симптомы медуллярной регенерации, а также изменение размера, формы и присутствие включений.

•Нормальные эритроциты у домашних плотоядных представлены округлыми безъядерными клетками в форме двояковогнутого диска (дискоцит), диаметр которого приблизительно равен 7 мкм у собаки и 6 мкм у кошки. В моноцеллюлярной зоне они представлены моноцеллюлярным слоем, имеют округлую форму с бледным свечением в центре (практически отсутствует у кошки), окрашены в желто-оранжевый цвет (умеренная эозинофилия). При этом можно наблюдать физиологически умеренный анизоцитоз3 (фото 12).

Фото 9. Обследование мазка при слабом увеличении: наблюдается скопление тромбоцитов.

22

Фото 10. Обследование целлюлярного монослоя (х 40): микроскопическая аутоагглютинация.

Фото 11. Исследование целлюлярного монослоя (х 40): эритроцитарные столбики.

1. Признаки регенерации

•Информация, полученная при анализе крови, не указывает на причину анемии или ее регенеративный характер. Но она позволяет оценить тяжесть нарушений путем подсчета количества эритроцитов, определения концентрации гемоглобина и гематокрита.

Исследование мазков крови животного, страдающего анемией, в совокупности с гематологическим анализом, проведенным с использованием автоматизированной техники, позволяет оценить степень регенерации и в некоторых случаях выявить причину возникновения анемии.

•Патогномоничные симптомы регенерации в мазках крови следующие: полихроматофилия; анизоцитоз; тельца Га- вела-Жоли; эритробласты (эритроциты, содержащие ядро), ассоциирующиеся с ретикулоцитозом, наблюдаемым при специальной окраске.

•Полихроматофилию (фото 13) определяют по наличию в крови эритроцитов большого диаметра фиолетовой окраски с элементами базофилии, которые контрастируют с оранжевым цветом нормальных эритроцитов. Эти полихроматофильные клетки соответствуют незрелым формам эритроцитов, которые широко распространены в костном мозге и визуализируются при дегенеративных изменениях костного мозга. В цитоплазме они содержат остатки рибосомальной РНК, которая придает фиолетовую окраску. Это соответствует у собаки и кошки ретикулоцитам с прижизненной окраской (мерцающий крезиловый голубой).

•Анизоцитоз (фото 14) - вариации размера эритроцитов. Увеличивается количество эритроцитов большого размера, находящихся в крови. Полихроматофилия связана с большим размером и соответствует анизоцитозу. Присутствие эритроцитов с более интенсивной окраской и большим размером эритроцитов

— веский аргумент в пользу регенеративной анемии.

•Эритробласты (ядерные эритроциты, незрелые формы), обычно находящиеся в костном мозге, имеют тенденцию иногда в малом количестве появляться в циркулирующей крови здорового организма.

3Анизоцитоз (гр. an, отрицательная приставка; isos, равный; kutos, клетка) [англ. anisocytosis]. Патологическое состояние эритроцитов, когда они сильно варьируются, в то время как в норме они должны быть одинаковыми. Этот термин также приемлем по отношению к вариациям диаметра лейкоцитов.

Они характеризуются большим размером, имеют серовато-фиолетовую цитоплазму, объемное, круглое, интенсивно окрашенное ядро. Их количество возрастает при регенеративной анемии, но присутствие только этих клеток не позволяет ставить диагноз на предполагаемое заболевание. Эритробласты можно наблюдать в большом количестве в циркулирующей крови при отравлении свинцом, выраженной септицемии, при различных заболеваниях крови (синдром миелопролиферации и т.д.).

•Для подтверждения регенеративной анемии обязательно требуется вести подсчет циркулирующих в крови ретикулоцитов после окраски голубым бриллиантовым крезилом (приложение 1). При проведении такой окраски различают зрелые формы эритроцитов с голубой интенсивной окраской цитоплазматического ретикулума. У собаки учитываются все клетки с такой окраской, тогда как у кошки подсчитываются только ретикулярные эритробласты (распознаются благодаря выраженному скоплению цитоплазматической грануляции).

2. Аномалии размера

•Сфероцитоз - наиболее часто встречаемая аномалия размера эритроцитов. Он свидетельствует об иммунологическом воздействии на эритроциты при развитии гемолитической анемии. Наличие сфероцитов объясняется частичным лизисом макрофагами печени и селезенки эритроцитов, покрытых антителами. Сфероциты распознаются по малому размеру, имеют однородную цитоплазму и интенсивную окраску, у них отсутствует бледное пятно в центре.

Эти клетки труднее идентифицировать у кошки: здоровые эритроциты у этого

вида не имеют в центре бледного окрашивания.

При гемолитической анемии, опосредованной иммуноглобулинами, мазки указывают на выраженную концентрацию сфероцитов, что ассоциируется с признаками регенерации костного мозга (присутствие полихроматофилов, телец Гаве- ла-Жоли и анизоцитоз).

•Симптомы медуллярной регенерации с наличием эритроцитов большого (макроциты) или малого (микроциты) размера можно наблюдать в циркулирующей крови. Эти клетки имеют тинкториальные и морфологические свойства нормальных эритроцитов. Значительно сложнее выявить аномалию: необходимо оценить средний объем эритроцитов (VGM) с помощью автоматического счетчика.

Среди причин, вызывающих снижение VGM, могут быть портосистемное шунтирование или арегенеративная анемия, вызванная недостаточностью железа. Аномалия размера является ранним признаком сидеропении (низкого содержания железа). Гипохромазия (пониженное окрашивание) проявляется значительно позже и возникает через несколько месяцев с момента начала заболевания.

•Некоторые особи, относящиеся к определенным породам собак (например, пудель), имеют VGM, превышающий норму. Такие макроциты иногда выявляют в мазках крови.

3. Аномалии формы

•Эритроциты собаки и кошки, циркулирующие в крови, обычно имеют округлую форму. Повышенное содержание эритроцитов разных форм называют пойкилоцитозом (фото 15). Этот неспецифический термин обозначает вариации

форм эритроцитов по отношению к физиологической норме без указания при-

Методы определения количества ретикулоцитов

Выполнение метода

—Смешать 500 мкл крови с 500 мкл раствора голубого бриллиантового Крезила (1 г порошка бриллиантового голубого Крезила и 0,4 г цитрата, разведенные в 100 мл изотонического раствора).

—Выдержать 10-20 минут при комнатной температуре.

—Нанести данную смесь на предметное стекло, как это осуществляют для получения мазка крови.

—Подсчитать количество наблюдаемых ретикулоцитов при большом увеличении (приблизительно для визуализации 100 эритроцитов в поле зрения микроскопа под иммерсией) и осуществить эту процедуру в 10 полях объектива. Полученное количество выражается в процентном содержании циркулирующих ретикулоцитов. Относительная оценка трансформируется в абсолютную величину путем умножения этого количество на общее число эритроцитов.

Интерпретация

Некоторые авторы говорят о регенерации костного мозга при количественном показателе 80000 - 30000 ретикулоцитов в мм3 у собаки и кошки. Другие говорят о 127500 - 75000 ретикулоцитах в мм3. При сомнительной оценке, или таковой, указывающей на нижнюю границу нормы, осуществляют повторный подсчет через два или три дня. Кинетика ретикулоцитов способствует более точной интерпретации.

Тельца Гавела-Жоли (фото 14) относятся к единичным включениям малого размера, имеют азурофильную и круглую форму, присутствуют в молодых эритроцитах, находящихся в фазе созревания. Они относятся к фазе нуклеарного материала эритробластов и элиминируются при созревании. Небольшой процент (менее 1%) может присутствовать у кошек в нормальном физиологическом состоянии. Их количество возрастает при регенеративной анемии, спленэктомии, у животных при лечении глюкокортикостероидами, химиотерапевтическими препаратами.

Приложение 3.

полой вене, вызывают вторичные реологические нарушения крови. Также механическая фрагментация эритроцитов может быть вызвана иммунологическими или физическими агрессиями (ДВС, гемангиосаркомой, выраженными воспалениями и т.д.).

4. Аномалии окраски

Интенсивность окраски эритроцитов пропорциональна концентрации содержащегося в них гемоглобина.

• Гипохромия (фото 16) определяется по наличию бледности в центральной части эритроцита в связи с выраженным снижением содержания гемоглобина. Часто выявляется при сидеропенической анемии. Гемоглобин концентрируется в виде тонкого периферического кольца в эритроцитах, которые называют аннулоцитами.

Большинство подобных анемий связано с недостаточностью железа вследствие хронической потери в системе пищеварения (язвы, разрушающиеся опухоли и т.д.).

•Напротив, некоторую степень гиперхромии (оптической) можно обнаружить при гемолитической анемии по присутствию сфероцитов, униформных эритроцитов при интенсивной их окраске.

5. Наличие включений

Обычно эритроциты имеют униформную (однородную) окраску без каких-либо включений. Большое количество эритроцитарных включений идентифицировано у

собаки и кошки, некоторые из них присутствуют в норме.

•Тельца Гейнца проявляются как протуберанции палевого цвета на мембране или внутри эритроцитов, вызваны окислением молекул гемоглобина. Они значительно проще идентифицируются с помощью специальных окрасок (метиленовым синим, голубым бриллиантовым крезилом), но их можно наблюдать при обычной окраске за счет большого размера.

•Присутствие телец Гейнца обычно отмечают у представителей семейства кошачьих в небольшом количестве (менее 3%). Это связано с большим содержанием сульфгидрильных групп на молекуле гемоглобина и объясняет повышенную чувствительность к процессам окисления. При большом количестве телец Гейнца у кошки предполагают в первую очередь отравление токсическими дозами препаратов, вызывающих окисление (парацетамол, потребление лука), а также заболевания, связанные с обменными процессами (диабет, гипертироидоз), или онкологической природы (злокачественная лимфома). При выраженной интоксикации окисленный гемоглобин может конденсироваться в части эритроцитов. Оставшаяся цитоплазма в оптическом поле выглядит опустошенной и образует эксцентроцит. Его морфология схожа с тельцами Гейнца.

•Исследование мазка крови позволяет выявить некоторых возбудителей заболеваний у собаки и кошки. Наиболее часто это гемобартенеллез (Hemobartonella felis) и пироплазмоз (Babesia canis).

•Гемобартенеллы имеют форму небольших кокков или палочек, локализующихся на поверхности мембраны эритроцитов, которые иногда с трудом поддаются дифференциации от артефактов, возникающих при приготовлении мазка крови.

•Пироплазмы характеризуются базофильными включениями в форме груши в цитоплазме эритроцитов. Сдвоенная форма является классической для заболевания, но интраили экстрацеллюлярную персистенцию четырех паразитов также можно наблюдать в мазках.

•Включения вирусных частиц при заболевании чумой также можно обнаружить в эритроцитах. Они располагаются в цитоплазме, имеют округлую форму, голубой и бледно-розовый цвет. В основном их наблюдают при остром течении инфекционного заболевания, когда симптомы носят слабо специфический характер. Несмотря на редкое проявление, эти включения могут быть единственным показателем при постановке диагноза на вирусное заболевание.

Фото 15. Исследование моноцеллюлярного слоя при большом увеличении (х100). Следует обратить внимание на варьирующиеся формы эритроцитов (эритроцитарный пойкилоцитоз) и тромбоциты большого размера (макротромбоциты).

25

Фото 16. Исследование моноцеллюлярного слоя при большом увеличении (х100). Следует отметить наличие аннулоцитов: эритроциты имеют выраженное просветление в центре по причине сниженного содержания гемоглобина.

Фото 17. Анормальные или бластные клетки, которые могут не идентифицироваться при автоматическом исследовании.

Основные положения

Высушивание мазков крови осуществляется на свежем воздухе, без теплового источника, который может вызвать наличие артефактов, которые мешают оценке морфологического статуса клеток крови.

Макроскопическая агглютинация является физиологичной у кошки.

У собаки она может соответствовать как формированию монетных столбиков, так и микроскопической агглютинации, часто возникающей при гемолитической анемии.

Необходимо уточнить наличие тромбоцитопении, определяемой при использовании автоматизированного исследования, с помощью внимательного исследования мазков, чтобы выявить скопления тромбоцитов, ответственных за псевдотромбоцитопению.

Присутствие полихроматофилов, наличие эритроцитарного анизоцитоза и Телец Гавела-Жоли на мазке крови являются симптомом регенеративной анемии.

В случае присутствия повышенного содержания активированных лимфоцитов необходимо вести систематический поиск персистенции хронического воспаления.

Приложение 4.

ляет распознать аномальные или бластные клетки в циркулирующей крови при злокачественных гемопатиях. Используемые в настоящее время автоматы, относящиеся к типу Coulter, не позволяют дифференцировать нормальные лейкоциты от аномальных. Эти клетки подсчитываются как нормальные лейкоциты, и их наличие может оказаться вне поля зрения клинициста (фото 17).

• Далее морфологический анализ выполняют при более сильном увеличении (х 40 или х 100) в зоне мазка с моноцеллюлярным слоем там, где хорошо просматривается морфология клеток. Определяют нейтрофильные гранулоциты (полинуклеарные нейтрофилы, PNN). Лимфоциты и моноциты представлены в достаточно большом количестве в циркулирующей крови, что позволяет провести морфологический анализ. У домашних плотоядных формула крови имеет нейтрофильный профиль. У молодых особей могут преобладать лимфоциты (наблюдается в возрасте до одного года).

• Другие группы лейкоцитов также могут изменяться, что имеет следующее объяснение: лимфоциты не проявляют признаков токсичности, но реагируют при стимуляции антигеном инфекционного агента, а также при иммунном или неопластическом процессе. Эти реактив-

ные лимфоциты, или «иммуноциты» ха- 27 рактеризуются увеличенным размером и выраженной базофилией. Другие модификации, например азурофильные цитоплазматические включения, также могут быть обнаружены в лимфоцитах, которые называют «зернистыми лимфоцитами» (фото 21). Их наблюдают в циркулирующей крови при неспецифической стимуляции иммунной системы (вирусные заболевания, недавно проведенная вакцинация), а также в случае новообразований и некоторых хронических нарушений (эрлихиоз). Эти активированные клетки относятся NK (естест-

венным киллерам).

•Лейкоцитарные включения встречаются крайне редко. Они относятся к морулам эрлихоза собак (Ehrlichia canis) в моноцитах и телам Лентза при заболевании чумой, которые включаются в лимфоциты, моноциты и нейтрофильные гранулоциты.

•Наличие эритрофагоцитов (моноциты, которые фагоцитируют эритроциты) можно наблюдать при гемолизе иммунной экстрацеллюлярной природы, например при бабезиозе.

Клиницист, располагающий автоматическим оборудованием для анализа крови, которое позволяет получить результаты на период консультации, имеет большие преимущества. Тем не менее, рекомендуется проводить дополнительные исследования мазка крови для того, чтобы оценить и объяснить аномалии системных нарушений.

Биохимическое

исследование гемостаза у собаки

Биохимическое исследование гемостаза не часто используется ветеринарными врачами, потому что отсутствие «оценки нормы» вызывает сложности в интерпретации

полученных результатов.

— система, состоящая из тромбомодулина, протеина С и протеина S (тромбомодулин эндотелиальных клеток связывается с тромбином путем активации плазматического протеина С и ингибирует факторы Va и VIII в присутствии протеина S).

На рисунке 3 представлена схема фибринолиза. Плазминоген, синтезируемый печенью и SMM, трансформируется в протеолитический энзим плазмин. Эта активация осуществляется тремя эндогенными путями:

•тип экстрансек с включением тканевого активатора плазминогена (t-PA);

•тип интрансек с участием проурокиназы (pro-UK);

•путь взаимодействия с лейкоцитарными и тромбоцитарными протеазами.

Также возможна активация медикаментозными средствами (стрептокиназа, урокиназа).

Плазмин, лизируя фибрин и фибриноген, вызывает образование продуктов деградации фибрина и фибриногена (ПДФ). Также он проявляет свою активность по отношению к другим факторам коагуляции (V, VIIIC и т.д.) и некоторым фракциям комплемента.

В системе фибринолиза имеются собственные ингибиторы: активации плазминогена, фиксации плазминогена к фибрину и антиплазмину ( 2-анти- плазмин, ( 2-макроглобулин, антитромбин III и т.д.).

БИОХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ГЕМОСТАЗА

Исследование первичного гемостаза

В практических условиях ветеринарный врач располагает небольшим количеством биохимических тестов, необ-

фактора (тромбопластина) и кальция.

Невозможно дать оценку референс контролю (стандартному контролю), потому что полученное время зависит от природы используемого тромбопластина. При использовании тромбопластина, полученного из экстракта головного мозга кролика, TQ у собаки варьируется в пределах 6-7 секунд, что значительно меньше, чем у человека. При использовании плазмы крови, разведенной в два раза (50%), TQ составляет 8 секунд. Нормальным результат считают в том случае, если ее показатель превышает 70%.

Протромбиновое время, или время Квика, отражает состояние экстрансекоидного и общего путей коагуляции плазмы. В частности, оно изменяется при снижении факторов комплекса протромбина (фактор II, V, VII и X). Выраженная гипофибриногенемия, как и циркуляция антикоагулянтов типа антипротромбиназы, может пролонгировать TQ. Данный метод слабо чувствителен к гепарину.

Тромбиновое время

Это время коагуляции плазмы крови, обедненной тромбоцитами, при наличии тромбина. Результаты анализов, полученные в лаборатории ветеринарной медицины города Тулузы, варьируются в пределах 18-30 секунд при использовании бычьего тромбина, разведенного 1/20.

Показано, что тромбиновое время зависит от качества фибриногена и присутствия ингибитора (антитромбин, выраженное увеличение продуктов распада фибриногена и фибрина). В последнем случае тест не откорректирован в сравнении с контрольной плазмой.

Аналитические тесты

С помощью хронометрических методов мы можем определять количественное содержание каждого фактора, участвующего в коагуляции плазмы. У собак ведут в основном поиск следующих факторов: I, II, V, совокупность VII+X, а также VIIIC и IX. Основной принцип этих тестов заключается в их простоте: определение времени коагуляции плазмы, смешивание плазмы больной собаки и коммерческой плазмы, которая содержит все факторы, за исключением тех, которые необходимо установить. Метод TQ используют в том случае, если речь идет о факторе экстрансекоидного или общего типа, а также о времени цефалина с активатором (факторе интрансекоидного типа). Полученные результаты оценивают в секундах и в процентном отношении к контрольной плазме собаки.