Vitamins[1]

Опыт 21. Количественное определение аскорбиновой кислоты в растительном сырье (методика ВНИИ растениеводства)

Подготовка растительного материала к анализу. При иссле-

довании картофеля из каждого клубня вырезают сектор наподобие лимонной дольки, чтобы захватить все слои клубня. При анализе кочанной капусты срез делают через все слои кочана.

Томаты и другие сочные плоды разрезают по вертикальной оси на 4-6 частей и для исследования берут одну часть. Пробы, взятые из нескольких клубней, кочанов, плодов, составляют среднюю пробу. Среднюю пробу плодов, овощей, листьев разрезают ножом из нержавеющей стали на стеклянной пластинке.

Мелкие плоды и ягоды растирают в ступке. При исследовании вишен, черешен, слив удаляюткосточки. Листья разрезаютнакусочки.

Ход анализа. На технических весах взвешивают 4-5 г исследуемого материала с точностью до 0,01 г. Навеску помещают в ступку, сразу же заливают 20 мл 1%-ного раствора хлористоводородной кислоты и быстро растирают до образования однородной кашицеобразной массы. Растертую гомогенную массу количественно переносят в мерную колбу емкостью 100 мл, обмывая ступку, пестик, воронку и шпатель 1%-ной щавелевой кислотой.

Содержимое колбы доводят до метки 1%-ной щавелевой кислотой, колбу закрывают пробкой, тщательно вэбалтывают в течение 1-2 мин и оставляют на 8-10 мин. Содержимое мерной колбы фильтруют (первые 10 мл фильтрата отбрасывают) или центрифугируют.

В колбу для титрования помещают 10 мл фильтрата и титруют из микробюретки емкостью 5 мл 0,001н раствором 2,6-дихлорфенол- индофенола до появления розовой окраски, устойчивой в течение 30 с. Параллельно проводят контрольный опыт.

1 мл 0,001н раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола соответствует

0,086 мг аскорбиновой кислоты. Расчет содержания аскорбиновой кислоты (Х мг/100 г продукта) проводят по формуле:

Х = К·(Vоп – Vконт)·0,086·100·100 / 10·А

80

где:

К – поправочный коэффициент к нормальности раствора 2,6-ди-

хлорфенолиндофенола;

Vоп – объём титранта, пошедший на опытное определение, мл;

Vконт – объём титранта, пошедший на контрольное определение, мл;

0,086 – титр 0,001н раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола, г/мл;

100 – объём мерной колбы, мл;

100 – масса объекта, в котором рассчитывается содержание, г;

10 – объём пипетки, мл;

А – навеска для анализа, г.

Приготовление 0,001н раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола. 3035 мг сухой натриевой соли 2,6-дихлорфенолиндофенола помещают в мерную колбу емкостью 200 мл, добавляют 120-150 мл воды и 4-5 капель 0,01 н раствора едкого натра, взбалтывают в течение 10-15 мин и оставляют на ночь. Раствор доводят водой до метки и фильтруют в склянку из темного стекла. При хранении в холодильнике раствор годен в течениенедели. Титр раствора проверяют ежедневно.

Установка поправочного коэффициента к нормальности раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола. В химический стаканчик помеща-

ют несколько кристаллов чистой аскорбиновой кислоты (примерно 1- 1,5 мг, взвешивать не надо) и растворяют их в 50 мл 2%-ной хлористоводородной кислоты. 5 мл полученного раствора титруют из микробюретки приготовленным приблизительно 0,001н раствором 2,6-дихлор- фенолиндофенола до появления розового окрашивания. Снова берут той же пипеткой в другую колбу 5 мл раствора аскорбиновой кислоты, добавляют несколько кристалликов иодистого калия, 2-3 капли раствора крахмала и титруют 0,001 н раствором иодата калия до появления голубого окрашивания. Поправочный коэффициент к нормальности раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола (К) вычисляютпо формуле

К = А/B

где:

А – количество миллилитров 0,001 н раствора йодата калия, израсходованное на титрование раствора аскорбиновой кислоты;

81

В – количество миллилитров раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола, по-

шедшее на титрование того же объёма того же раствора аскорбиновой кислоты.

Опыт 22. Количественное определение аскорбиновой

кислоты в окрашенном растительном сырье

Взятие пробы на анализ проводят, как указано в опыте №21. Окрашенную пробу помещают в стаканчик для титрования, добавляют 5 мл хлороформа и титруют при постоянном перемешивании до появления розовой окраски в хлороформном слое. Этот метод неприемлем в том случае, если хлороформный слой окрашивается еще до титрования. Расчет результатов проводят по формуле, представленной в опыте №21.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

1.Объясните, почему аскорбиновую кислоту нецелесообразно определять методом нейтрализации?.

2.На каких свойствах аскорбиновой кислоты основаны её реакции с нитратом серебра, метиленовой синью, красной кровяной солью? Ответ подтвердите уравнениями реакций.

3.Если к раствору пиридоксина гидрохлорида добавить раствор хлорида железа (III), появляется красное окрашивание (см. опыт 8), которое исчезает после добавления аскорбиновой кислоты. Объясните это явление.

4.Какие химические реакции происходят с аскорбиновой кислотой при тепловой обработке пищевых продуктов.

2.1.7. ОПРЕДЕЛЕНИЕ НИКОТИНОВОЙ КИСЛОТЫ И НИКОТИНАМИДА

Опыт 23. Идентификация никотиновой кислоты

А. 0,15 г препарата растворяют в 15 мл воды при нагревании.

1.К 3 мл теплого раствора препарата прибавляют 1 мл 5%-ного раствора сульфата меди. Выпадает синий осадок.

2.К 10 мл такого же раствора прибавляют 0,5 мл 10%-ного раствора сульфата меди и 2 мл 5%-ного раствора роданида аммония. Появляется зеленое окрашивание.

82

Б. 0,1 г препарата нагревают с 0,1 г безводного карбоната натрия. Появляется запах пиридина.

Опыт 24. Количественный анализ раствора никотиновой

кислоты 1%-ного для инъекций

20 мл препарата помещают в мерную колбу емкостью 100 мл, прибавляют 2 капли раствора фенолфталеина и прикапывают 1М раствор гидроксида натрия до розового окрашивания. Добавляют 10 мл 5%-ного раствора сульфата меди и оставляют на 10 мин, после чего раствор доводят до метки водой. Раствор фильтруют, отбрасывают первые 20-25 мл фильтрата. 50 мл фильтрата помещают в колбу для титрования, прибавляют 10 мл 8%-ной хлористоводородной кислоты, 2 г йодида калия и выделившийся йод титруют 0,1М раствором тиосульфата натрия, добавляя в конце титрования индикатор крахмал (1 мл), до исчезновения синего окрашивания.

Параллельно проводят контрольный опыт.

1 мл 0,1М раствора тиосульфата натрия соответствует 0,02462 г никотиновой кислоты.

Опыт 25. Количественное определение субстанции

никотиновой кислоты

Около 0,15 г препарата (точная навеска) помещают в колбу для титрования, растворяют в 15 мл свежепрокипяченной горячей воды и по охлаждении титруют 0,1М раствором едкого натра до не исчезающего в течение 1 мин розового окрашивания.

1 мл 0,1М раствора едкого натра соответствует 0,1231 г никотиновой кислоты.

Опыт 26. Идентификация никотинамида

0,1 г препарата нагревают с 0,1 г безводного карбоната натрия; развивается запах пиридина.

0,1 г препарата нагревают с 2 мл 0,1М раствора едкого натра; появляется запах аммиака (отличие от никотиновой кислоты).

83

Опыт 27. Количественное определение субстанции

никотинамида

Около 0,15 г предварительно высушенного препарата (точная навеска) растворяют в 20 мл безводной уксусной кислоты и титруют 0,1М раствором хлорной кислоты с индикатором кристаллический фиолетовый до появления изумрудно-зеленого окрашивания.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

1.Как с помощью одного реактива – гидроксида натрия – идентифицировать никотиновую кислоту и никотинамид и отличить их друг от друга.

2.Объясните, почему никотиновая кислота образует осадок при взаимодействии с сульфатом меди, а никотинамид – нет.

3.Будет ли никотинамид давать зеленое окрашивание при действии сульфата меди и роданида аммония так же, как никотиновая кислота (см. опыт 23 (А2))?

4.Напишите уравнения реакций, лежащих в основе йодометрического метода количественного анализа никотиновой кислоты, и определите молярную массу ее эквивалента в этом методе.

2.1.8.ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИТАМИНОВ ГРУППЫ А

Опыт 28. Идентификация витаминов группы А

А. 1 каплю масляного раствора ретинола ацетата или 2-3 капли рыбьего жира растворяют в 1 мл хлороформа и добавляют 5 мл насыщенного раствора хлорида сурьмы в перегнанном хлороформе; появляется синее окрашивание.

Б. 1 каплю масляного раствора ретинола ацетата или 2-3 капли рыбьего жира растворяют в 1 мл хлороформа и добавляют 1 каплю концентрированной серной кислоты и встряхивают; возникает синефиолетовое окрашивание, которое быстро переходит в краснобуроватое и затем в бурое.

В. Раствор ретинола ацетата с концентрацией около 3 мкг/мл в абсолютном этиловом спирте, свободном от альдегидов, имеет максимум поглощения при 326±1 нм.

84

Опыт 29. Количественное определение витамина А

в тресковом рыбьем жире

Около 1 г жира (точная навеска) помещают в колбу емкостью 100 мл, снабженную обратным холодильником; прибавляют 30 мл спирта, не содержащего альдегидов, З мл 50%-ного водного раствора гидроксида калия и дефлегмируют смесь 30 мин. Содержимое колбы охлаждают, добавляют 50 мл воды и переносят в делительную воронку. Смесь экстрагируют 50 мл эфира, а затем еще2 раза по 30 мл эфира. Объединенные эфирные вытяжки промывают водой по 30-40 мл до нейтральной реакции промывных вод (проба с фенолфталеином). К промытым эфирным вытяжкам добавляют 8 г безводного сульфата натрия и оставляют на 30 мин в темном месте, периодически встряхивая. Затем фильтруют содержимое через бумажный фильтр в колбу для перегонки. Сульфат натрия на фильтре промывают несколькими порциями эфира, который фильтруют в ту же колбу. Эфир отгоняют в токе азота или аргона на водяной бане при температуре не выше 50 °С. Неомыляемый остаток растворяют в абсолютном спирте до получения раствора, содержащего в 1 мл около 3 мкг (8-10 МЕ) витамина А. Измеряют оптическую плотность этого раствора на спектрофотометре в кювете с толщиной слоя 1 см при длинах волн 311 нм; 324,5 нм и 334 нм, применяя в качестве контрольного раствора абсолютный спирт.

Содержание витамина А в международных единицах (МЕ) в 1 г жира (Х) вычисляют по формуле

Dиспр = 7·D324,5 – 2,912·D311 – 4,088·D334 (D324,5, D311, D334 –– оптические плотности раствора при соответствующих длинах волн);

а – навеска препарата, г;

V – объём спиртового раствора, приготовленный для фотометрирования,

мл;

1850– коэффициент пересчета в МЕ.

Рыбий жир должен содержать не менее 350 МЕ витамина А в 1 г.

85

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

1.С помощью каких реакций можно отличить ретинола ацетат от других жирорастворимых витаминов (D, K, E)?

2.Предложите метод качественного определения ацетильной группы в ретинола ацетате.

3.Зная, что за Международную Единицу действия (МЕ) витамина А принимается 0,3 мкг ретинола, определите не менее скольких мг витамина А должно содержаться в 100 г трескового рыбьего жира.

2.1.9. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИТАМИНОВ ГРУППЫ D

Опыт 30. Определение витамина D в масляном растворе

эргокальциферола

0,3 мл раствора эргокальциферола в масле растворяют в 3 мл хлороформа и испытывают? как описано ниже:

а) к 1 мл хлороформного раствора препарата добавляют 3-4 капли хлористого ацетила и 5 мл насыщенного раствора хлорида сурьмы в хлороформе; появляется оранжево-розовое окрашивание (отличие от витамина А, см. опыт 25);

б) к 2 мл хлороформного раствора препарата добавляют 1 мл 1%- ного раствора брома в хлороформе (тяга!); через некоторое время появляется зеленое или голубовато-зеленое окрашивание.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

1.Напишите уравнение реакции эргокальциферола с бромом.

2.Объясните, почему витамин D дает с хлоридом сурьмы оранжево-розовое окрашивание, а витамин А – синее. От чего зависит цвет образующихся комплексов?

3.Можно ли реакцию с хлоридом сурьмы проводить во влажной пробирке? С какой целью в этой реакции добавляется хлористый ацетил?

2.1.10. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИТАМИНОВ ГРУППЫ Е

Опыт 31. Идентификация токоферола ацетата

0,2-0,3 мл 5%-ного масляного раствора токоферола ацетата растворяют в 5 мл абсолютного этилового спирта, добавляют 1 мл ды-

86

мящей азотной кислоты и осторожно нагревают в течение 15 мин на водяной бане при температуре около 80 °С (тяга!); появляется краснооранжевое окрашивание.

Опыт 32. Количественное определение токоферола ацетата

в масляных растворах

Точную навеску масляного раствора препарата, содержащую около 0,12 г токоферола ацетата, помещают в круглодонную колбу емкостью 100 мл, снабженную обратным холодильником, добавляют 18 мл абсолютного спирта, 2 мл концентрированной серной кислоты и кипятят в течение 2 ч на водяной бане.

Смесь охлаждают до комнатной температуры, количественно переносят в мерную колбу емкостью 50 мл и доводят объем раствора до метки абсолютным спиртом. 10 мл этого раствора помещают в колбу для титрования, добавляют 10 мл спирта, 5 мл воды, 1-2 капли 0,5%-ного раствора дифениламина в 85%-ной серной кислоте и титруют при постоянном перемешивании 0,01М раствором сульфата церия до появления сине-фиолетового окрашивания, устойчивого в течение 10 с.

Параллельно проводят контрольный опыт.

1 мл 0,01М раствора сульфата церия соответствует 0,002364 г токоферола ацетата

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

1.Напишите уравнение реакции токоферола ацетата с азотной кислотой.

2.Объясните, почему токоферола ацетат гораздо более устойчив к действию окислителей, чем токоферол.

3.С какой целью перед цериметрическим определением токоферола ацетата его кипятят в течение 2 ч в присутствии концентрированной серной кислоты? Какая реакция при этом происходит?

4.Напишите уравнение реакции токоферола с сульфатом церия и определите молярную массу эквивалента токоферола ацетата в цетиметрическом методе его анализа.

87

ПРАКТИЧЕСКАЯ КОНТРОЛЬНАЯ РАБОТА

ПО АНАЛИЗУ ВИТАМИНОВ

Задание. Каждый студент получает 10 мл раствора, содержащего предполагаемый витамин неизвестной концентрации.

Цель работы – провести качественный и количественный анализ раствора витамина.

Алгоритм выполнения

1.С помощью качественных реакций или метода УФ-спектро- скопии установить наличие предполагаемого витамина в растворе.

2.Выбрать и согласовать с преподавателем метод количественного анализа обнаруженного в растворе витамина.

3.Составить методику количественного анализа с учетом ожидаемой концентрации его в растворе и согласовать еёс преподавателем.

4.Провестиколичественное определениеи обработать результаты.

5.Все этапы работы запротоколировать и сдать отчет.

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК

1.Государственная фармакопея СССР. Х изд. М.: Медицина, 1961.

2.Фердман, Д.Л. Биохимия: учебник для вузов/ Д.Л. Фердман. – М.: Высш.

шк., 1966. – 644 с.

3.Малер, Г. Основы биологической химии: пер с англ./ Г. Малер, Ю. Кордес. –

М.: Мир, 1970. – 567 с.

4.Химия биологически активных природных соединений / под ред. Н.А. Пре-

ображенского. – М.: Химия, 1970. – 512 с.

5.Современные методы в биохимии / под ред. В.Н. Ореховича. – М.: Медици-

на, 1977. – 392 с.

6.Яхимович, Р.И. Химия витаминов D / Р.И. Яхимович. – Киев: Наукова дум-

ка, 1978. – 248 с.

7.Шрайнер, Р. Идентификация органических соединений: пер. с англ./ Р.

Шрайнер, Р. Фьюзон, Д. Кёртин и др. – М.: Мир, 1983. – 703 с.

8.Химическая энциклопедия: в 5 т. Т.1. – М., 1988. – 623 с

9.Досон, Р. Справочник биохимика: пер с англ. / Р. Досон, Д. Элиот, У. Элиот

и др. – М.: Мир, 1991. – 543 с.

10.Девис, С. Витамин С: Химия и биохимия: пер. с англ. /С. Девис, Д. Остин,

Д. Патридж. – М.: Мир, 1999. – 176 с.

11.Кольман, Я. Наглядная биохимия: пер. с нем. / Я. Кольман, К.-Г. Рем. – М.:

Мир, 2000. – 469 с.

88

12.Руководство к лабораторным занятиям по фармацевтической химии: учеб.

пособ./ Э.Н. Аксенова, О.П. Андрианова, А.П. Арзамасцев и др. – М., 2001. – 384 с.

13.Кнорре, Д.Г. Биологическая химия: учебник для вузов / Д.Г. Кнорре, С.Д.

Мызина.– М.: Высш. шк., 2002. – 479 с.

14.Арзамасцев, А.П. Большая российская энциклопедия лекарственных средств: в 2 т. / А.П. Арзамасцев, А.А. Баранов, Ю.Н. Беленков и др. – М.:

Ремедиум, 2002. – 1384 с.

15.Энциклопедия биологической химии: в 4 т. Т.4. М., 2004. – 503 с.

16. . Арзамасцев, А.П. Фармацевтическая химия / А.П. Арзамасцев. М.: Гэотар Медицина, 2004. – 640 с.

17.Лифляндский, В. Витамины и минералы / В. Лифляндский. СПб.: НЕВА, 2006. – 640 с.

18.Беликов, В.Г. Фармацевтическая химия / В.Г. Беликов. М.: МЕДэкспрес-

информ, 2007. – 624 с.

19.Мокшина, Н.Я. Экстракция и определение ароматических α-аминокислот и водорастворимых витаминов – закономерности и новые аналитические решения: автореф. дис. … д – ра хим. наук / Н.Я. Мокшина. М., 2007.

89