2.3.1.3 Исследование адаптивного иммунитета

Определение популяционного и субпопуляционного спектра лимфоцитов крови проводили с помощью иммунофенотипирования методом непрямой иммунофлюоресценции с использованием моноклональных антител (МКА) серии ICO производства НИИ «Препарат» (Н. Новгород). Проводили типирование зрелых Т-лимфоцитов (СD3+) и их основных популяций СD4+, СD8+, В-лимфоцитов (СD22+), естественных киллеров, NK-клеток (СD16+), маркера ранней активации лимфоцитов (CD25+), клеток с рецептором к трансферрину (CD71+), клеток с рецептором готовности к апоптозу APO-1/Fas (CD95+), клеток с HLA-DR.

50 мкл клеточной суспензии лимфоцитов вносили во все лунки планшета, соответствующие необходимой панели МКА, и две лунки для контроля; клетки осаждали центрифугированием при 700g в течение 5 минут, удаляли супернатант, добавление к осадку соответствующие МКА в рабочем разведении. Затем осадок ресуспендировали и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 минут; трехкратно отмывали средой 199 центрифугированием при 700g в течение 5 минут; добавляли к осажденным и отмытым клеткам, меченые люминесцентным красителем (ФИТЦ) Fab-2 фрагменты кроличьих антител против иммуноглобулинов мыши (МКА) в рабочем титре в количестве 20 мкл и инкубировали в течение 20 минут при температуре +4⁰С. После трехкратного отмывания взвеси клеток средой 199 на центрифуге при 700g в течение 5 минут переносили в лунки ранее приготовленный трафарет из парафиновой пленки по 25 мкл ресуспендированной клеточной взвеси из лунок; фиксировали клетки путем инкубации в формалиновой камере 30 минут. Учет светящихся клеток проводили в микроскопе «ЛЮМАМ-АИ1» (Россия) при увеличении объектива • 90 и окуляра • 2,5 (фильтр возбуждения 495 нм, эмиссии 525 нм). Подсчитывали не менее 200 клеток, результат выражали в % CD-позитивных клеток (за вычетом % светящихся клеток в лунке отрицательного контроля), с последующим пересчетом в абсолютные показатели (на единицу числа лимфоцитов периферической крови).

Определение уровня иммуноглобулинов в сыворотке проводили с помощью иммуноферментного анализа с тест-системами производства «Вектор-Бест» (Новосибирск). Концентрацию Ig A,Ig M, Ig G определяли на фотометре «Multiscan plus» («Labsystems», Финляндия) при длине волны 450 нм и выражали в граммах белка на 1 л биологической жидкости (г/л)

Оценка концентрации циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) проводилась по методу В.Гашковой и соавт. (1978) основанный на осаждении белков сыворотки полиэтиленгликолем (ПЭГ-М, масса 6000). К одной части исследуемой сыворотки добавляют две части боратного буферного раствора (рН – 8,4). На боратном буфере готовят 4,166% раствор ПЭГ. Сыворотку, разведенную буферным раствором 1:3 в количестве 0,22 мл смешивают с 2 мл ПЭГ 4,166% и инкубируют в течение часа при комнатной температуре, затем фотометрически (спектрофотометр «СФ-46») при 450 нм определяют разницу в светопроницаемости пробирок опытной и контрольной (сыворотка обследуемого с буфером без ПЭГ). Этим исключаем собственное окрашивание сыворотки. Формула для подсчета результата:

ЦИК = (опыт1 + опыт2) / 2 - контроль • 1000.

Результат выражали в условных единицах (у.е.).

Оценку гуморального иммунного ответа крыс проводили по количеству антителообразующих клеток в селезенке крыс, иммунизированных аллогенными эритроцитами, по A. J. Cunningham (1965) [6]. Крыс наркотизировали диэтиловым эфиром, иммунизировали внутрибрюшинной инъекцией аллогенных эритроцитов. Для иммунизации использовали 10% взвесь эритроцитов в 0,9% NaCl (1 мл суспензии содержит 10⁹ клеток), взвесь вводили в объеме 1 мл на 100г массы тела (доза 10⁷ эритроцитов на 1 г массы). Через 5 дней после иммунизации животных забивали, извлекали и взвешивали селезенку, отделяли от органа кусочек массой 30 мг. Полученную навеску с помощью стеклянного гомогенизатора растирали в среде 199, которую добавляли из расчета 1 мл на 3 мг ткани. Гомогенат фильтровали, добавляли 0,1 мл 10% взвеси аллогенных эритроцитов и 0,1 мл 20% раствора комплемента (1:1:1), перемешивали и заполняли камеры, инкубировали 90 мин. в термостате (37°С). Использовали камеры из предметных и покровных стекол, как описано у Волчегорского И.А. и соавт. [6]. С помощью лупы подсчитывали в камерах число бляшек гемолиза. Абсолютное содержание АОК в селезенке вычисляли по формуле:

3 • количество бляшек в чашке • А • С • В • D, где

3 – коэффициент разведения гомогената навески при смешивании с суспензией аллогенных эритроцитов и раствором комплемента;

А - масса селезенки;

В - масса навески органа;

С – объем гомогената навески;

D – объем камеры.

Исследование реакции гиперчувствительности замедленного типа у крыс, иммунизированных аллогенными эритроцитами. Интенсивность ГЗТ оценивали по выраженности воспалительного отека стопы, в которую вводили аллогенные эритроциты, использовавшиеся для предварительной иммунизации. Крыс иммунизировали эритроцитами барана (ЭБ). Через 4 суток после иммунизации крыс наркотизировали диэтиловым эфиром и вводили разрешающую дозу ЭБ (10⁷ клеток на 1 г массы тела) в подошвенную поверхность стопы. Для инъекции использовали отмытые ЭБ (10¹⁰ клеток / мл), вводили в лапу из расчета 0,1 мл на 100 г массы тела. В контрольную лапу вводили эквиобъёмное количество 0,9% NаCl. Через 24 часа после инъекции разрешающей дозы ЭБ крыс умерщвляли цервикальной дислокацией, аккуратно рассекали голеностопные суставы и отделяли обе стопы. Волюмометрическим методом определяли объем обеих стоп. Интенсивность ГЗТ рассчитывали как разность между объемом стопы, в которую вводили ЭБ, и объемом стопы, куда вводили 0,9% NаСl.