2.2.2. Эксперименты в условиях in vitro

Для экспериментов в условиях in vitro использована цельная кровь 11 клинически здоровых людей-добровольцев и 36 больных с термической травмой.

2.3. Методы исследования

2.3.1. Иммунологические методы исследования

2.3.1.1. Оценка спонтанной и индуцированной секреторной активности мононуклеаров периферической крови в условиях in vitro

Объектом исследования служила венозная кровь, взятая у здоровых людей-добровольцев и у больных с термической травмой натощак, в утренние часы. Кровь стабилизировали гепарином из расчета 10 ЕД/мл. Фракцию мононуклеаров выделяли по методу на градиенте плотностью 1,077 г/мл при центрифугировании (400 g 45 минут) с использованием фиколла и верографина. Для формирования среды плотностью 1,077 г/см³ использовали 9% (масса/объем) раствор фиколла-400 («ДиаМ», Москва) и 60 % официнальный урографин («Schering», Германия). Опалесциирующее кольцо мононуклеаров забирали из интерфазы пастеровской пипеткой и трижды центрифугированием отмывали средой 199 путем при 689g в течение 5-7 минут. Отмытые и ресуспендированные клетки доводили до концентрации 1•10⁷ клеток/мл. Их жизнеспособность оценивали путем окраски их 0,2 % раствором трипанового синего, жизнеспособность составляла не менее 98%.

Культивирование клеток проводили при 5% содержании углекислого газа в воздушной среде при температуре 37⁰С в течение 1 часа. В стерильных условиях содержание ячеек было аспирировано, с последующим двухкратным промыванием от неприлипших клеток раствором Хенкса. Затем в каждую ячейку добавляли по 250 мкл 10 % эмбриональной телячьей сыворотки и 80 мкг/мл гентамицина. Далее клетки культивировали в течение 72 часов, в условиях термостата при 5% содержания углекислого газа в воздушной среде, при температуре 37⁰С, в супернатанте определяли концентрацию цитокинов.

2.3.1.2. Исследование врожденного иммунитета

Определение количества лейкоцитов и лейкоцитарной формулы. Количество лейкоцитов в периферической крови определяли общепринятым меланжерным методом в камере Горяева. Лейкоцитарную формулу подсчитывали в мазках крови, фиксированных метиловым спиртом и окрашенных азур II-эозином по Романовскому-Гимзе [43]. Подсчитывали 200 лейкоцитов с дифференциацией эозинофилов, базофилов, метамиелоцитов, палочкоядерных и сегментоядерных нейтрофилов, лимфоцитов, моноцитов. Их количество выражали в относительных (%) и абсолютных (•10⁹/л) величинах.

Функциональную активность фагоцитов исследовали по показателям НСТ-теста и фагоцитозу.

Исследование поглотительной способности фагоцитов периферической крови проводили на модели поглощения частиц латекса. Для оценки фагоцитоза 200 мкл крови смешивали с 20 мкл взвеси частиц монодисперсного (диаметр 1,7 мкм) полистерольного латекса. После 60 минут инкубации при температуре 37⁰С из суспензии готовили препараты, которые высушивали, фиксировали метанолом и окрашивали азур II – эозином по Романовскому-Гимзе. С помощью иммерсионной микроскопии учитывали активность фагоцитоза – % клеток, захвативших хотя бы одну частицу латекса, интенсивность фагоцитоза – число поглощенных микросфер латекса в 100 подсчитанных клетках и фагоцитарное число – число поглощенных микросфер латекса на один фагоцит.

НСТ-тест проводили, учитывая интенсивность восстановления фагоцитами нитросинего тетразолия (НСТ) в его нерастворимую форму - диформазан по методу А.Н. Маянского и М.Е. Виксмана (1979). Проводили спонтанный и индуцированный НСТ-тест.

В пробирки с 0,2 мл крови добавляли 0,1 мл 0,2% раствора стандартно разведенного нитросинего тетразолия в 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,4). Для оценки индуцированного НСТ-теста в каждую лунку добавляли 20 мкл суспензии частиц монодисперсного (диаметр 1,7 мкм) полистерольного латекса (индуцированная серия) или 20 мкл 0,9% NaCl (спонанная серия). После 30-минутной инкубации при температуре 37⁰С к реакционной смеси добавляли 3 мл 0,1 % соляной кислоты для остановки реакции. Пробирки центрифугировали при 1000 об./мин в течение 5 мин. Надосадочную жидкость сливали, из осадка готовили мазки. После сушки препараты фиксировали метанолом и 5минут окрашивали 0,1% водным раствором сафранина. С помощью микроскопии при увеличении 90х10х1,5 определяли % клеток, восстанавливающих НСТ, и интенсивность реакции по активности восстановления НСТ, для чего НСТ-позитивные клетки делили на 3 группы:

1 – клетки с гранулами диформазана в цитоплазме общей площадью менее 1/3 площади ядра;

2 – клетки с гранулами диформазана в цитоплазме более 1/3 площади ядра;

3 – клетки с гранулами диформазана, превышающими размеры ядра.

Для получения коэффициента интенсивности реакции количество клеток первой группы, выраженное в процентах, умножали на 1, второй группы – на 2, третьей – на 3, результаты суммировали и делили на 100.