3.3.4. Эмиссионная фотометрия

Спектры испускания, или эмиссионные, получают при возбуждении атомов различными способами (тепловыми столкновениями, фотонами, электронным ударом и т.д.). Время жизни возбужденного состояния невелико и составляет 10^-7-10^-8 с. В течение этого времени атом теряет избыточную энергию путем испускания кванта электромагнитного излучения. На рисунке представлены спектры испускания и спектры поглощения атомов натрия, водорода и гелия.

Аналогичные спектры неатомизированных веществ, как уже обсуждалось в теме атомно-асборбционной фотометрии, имеют более широкие полосы, но также сдвинуты друг относительно друга (длина волны, соответствующая максимуму спектра поглощения, меньше длины волны, соответствующей максимуму спектра испускания).

Люминометрия и флуориметрия

Излучение (испускание) света молекулами – люминесценция – может происходить при передаче энергии им в различных процессах:

- воздействие потоком электронов (катодными лучами) – катодолюминесценция;

- тепловой нагрев – термолюминесценция;

- химические реакции – хемилюминесценция;

- воздействие электрическим током – электролюминесценция;

- ультразвуковое воздействие – сонолюминесценция;

- воздействие механическим трением – триболюминесценция;

- облучение ионизирующей радиацией – радиолюминесценция;

- облучение ультрафиолетовым и видимым светом – фотолюминесценция или флуоресценция.

В биомедицинских аналитических исследованиях, в основном, используют флуоресценцию и хемилюминисценцию.

Как уже отмечалось, в основе явления люминесценции лежат процессы поглощения энергии с последующим излучением фотонов. Механизм проявления эффекта люминесценции показан на рисунке.

Схема энергетических уровней внутримолекулярных переходов:

1 - абсорбция; 2 - флуоресценция; 3 - фосфоресценция; а - излучательные переходы; б - безызлучательные переходы.

Молекула, находившаяся в основном состоянии S₀, в результате поглощения энергии переходит в состояние возбуждения S₁ с уровнями колебаний 0', 1' и т. д. Возбужденная молекула через 10^-7–10^-8 с возвращается в основное состояние, испуская флуоресцентное излучение. Так как чаще всего обратный переход происходит с самого низкого уровня колебаний в возбужденном состоянии на самый высокий уровень колебаний основного состояния, длина волны флуоресцентного излучения больше, чем возбуждающего излучения (правило Стокса).

За счет рассеяния энергии без излучения возможен переход из возбужденного состояния S₁ в метастабильное состояние Т, которое имеет продолжительность жизни от 10^-3 до нескольких секунд. Излучательный переход из метастабильного состояния называют фосфоресценцией. Она находится в области еще более длинных волн, чем флуоресценция, и продолжается относительно долго после прекращения воздействия.

Явление флуоресценции получило свое название от природного минерала – флюорита CaF₂, у которого оно впервые наблюдалось. Веществами, способными к свечению – флуорофорами – являются такие биологические соединения как триптофан, тирозин, фенилаланин, нуклеотиды (НАДН, НАДФ-Н), флавины, порфирины, хлорофиллы, каротиноиды, некоторые витамины, окисленные липиды, белки и другие. В качестве меток при проведении флуофесцентного и люминисцентного анализа часто используются флуорофоры и люминофоры, примеры которых представлены на рисунке:

Флуоресцентные метки (флуорофоры) широко используются в биохимии, биотехнологии, клеточной биологии и биологии развития в качестве маркеров экспрессии генов и локализации белков в различных биологических системах, а также их взаимодействий с окружающей средой. Для проведения исследования флуорофор прикрепляется к изучаемому белку.