2.1.3. Подсчет лейкоцитов в счетной камере
с использованием меланжеров для разведения крови
Для работы необходимы: донорская кровь, смеситель (меланжер) для лейкоцитов, камера с сеткой Горяева, 5% раствор уксусной кислоты, подкрашенный метиленовым синим, микроскоп, вата.
Проведение работы. Взятие и разведение крови осуществляется с помощью смесителя для лейкоцитов (рис.1.). Смеситель имеет меньший объем ампулы по сравнению со смесителем для эритроцитов и содержит белую бусинку. Набирают кровь до метки «0,5», а затем - уксусную кислоту до метки «11», чем достигают разведения в 20 раз. Для разрушения оболочки эритроцитов и подкрашивания ядер лейкоцитов после перемешивания содержимого ждут 5 минут.
Заполнение камеры проводят также, как описано в работе 3.1.1. Подсчет лейкоцитов осуществляется в 25 больших квадратах, что соответствует 25 16 = 400 малым. Количество лейкоцитов в 1мкл крови вычисляют по фопрмуле:
Х = (А 4000 200) / 80,
где А - найденное количество лейкоцитов в 400 больших квадратах;
20 - степень разведения крови;
1/4000 мм3 - объем разведенной крови над малым квадратом.
Для определения числа лейкоцитов в 1 л крови, полученный результат умножают на 106.
Ошибка метода составляет в среднем 7%.
Источники ошибок при подсчете лейкоцитов те же, что и при подсчете эритроцитов. Кроме того, в число лейкоцитов могут войти и эритробласты, если они имеются в крови. Их наличие у испытуемого выясняют при изучении морфологии клеток в фиксированных и окрашенных препаратах.
Оформление протокола. Коротко описать метод, указать чем разводят кровь для подсчета лейкоцитов; записать формулу расчета количества лейкоцитов - провести ее анализ. Выписать нормальные значения количества лейкоцитов у мужчин, женщин (новорожденных).
2.1.4. Подсчет лейкоцитов с использованием пробирочного
метода разведения крови
Для работы необходимы: донорская кровь, химические или серологические пробирки с пробками, капиллярная пипетка от гемометра Сали, градуированная пипетка для отмеривания разводящей жидкости на 1 мл, камера с сеткой Горяева, 4-5% раствор уксусной кислоты (подкрашенный метиленовым синим), дистиллированная вода, микроскоп, вата.
Проведение работы. В чистую пробирку точно отмеривают 4мл 5% раствора уксусной кислоты. Капиллярной пипеткой от гемометра Сали набирают кровь до метки (20 мкл) и осторожно выдувают ее в разводящую жидкость; промывают этой жидкостью капилляр, пробирку закрывают пробкой и тщательно перемешивают. Таким образом, достигается разведение крови в 20 раз. После взятия крови капиллярная пипетка должна быть промыта несколько раз дистиллированной водой.
Заполнение камеры, подсчет лейкоцитов, анализ результатов и оформление протокола осуществляют, как указано в работе 3.1.1. Источник ошибок и точность метода такие же, как и в работе 3.1.1.
2.2. Определение количества гемоглобина в крови
по методу Сали
Гемоглобин (Hb) – основной дыхательный пигмент эритроцитов, относящийся к хромопротеидам и обеспечивающий ткани кислородом, состоит из белка – глобина и гема – соединения протопорфирина IX с железом. Последний придает гемоглобину характерную окраску. Присоединение к гему различных химических групп сопровождается изменением окраски. На этом основано определение концентрации гемоглобина крови.
Для определения содержания Hb в крови предложено много различных методов. Наибольшее распространение получили колориметрические методы, основанные на колориметрии производных гемоглобина. В настоящее время принят унифицированный гемиглобинцианидный метод определения количества гемоглобина. Гемоглобин окисляют в метгемоглобин (гемиглобин) железосинеродистым калием; образующийся с ацетонциангидрином окрашенный цианметгемоглобин (гемиглобинцианид) определяют колориметрически с помощью фотоэлектроколориметра, счетчика и гематологического автомата.
Наиболее распространенным в прошлом было определение количества гемоглобина по методу Сали. Этот метод чрезвычайно прост и быстро выполним, но недостаточно точен. Он основан на колориметрии солянокислого гематина. При смешивании крови с соляной кислотой Hb превращается в солянокислый гематин, имеющий коричневый цвет. Полученную смесь разбавляют дистиллированной водой до цвета раствора в стандартных пробирках, находящихся в крайних гнездах гемометра. Этот раствор имеет интенсивность окраски, соответствующую содержанию гемоглобина, равному 166,7 г/л.
В норме в крови содержится около 140 г/л гемоглобина (у женщин 120-140 г/л, у мужчин 130-160 г/л, у новорожденных – 217 г/л).
Рис.3. Гемометр Сали
1 - пробирки со стандартным раствором; 2 – пробирка для исследуемой крови; 3 - пипетка для крови; 4 - пипетка для воды
Для работы необходимы: донорская кровь, гемометр Сали, 0.1N раствор соляной кислоты, дистиллированная вода.
Проведение работы
В градуированную пробирку гемометра наливают до первой метки 0,1N раствор соляной кислоты.
Капиллярной пипеткой набирают кровь точно до метки 20 мм и осторожно выдувают ее на дно пробирки. Не вынимая пипетки из пробирки, промывают ее соляной кислотой, встряхивая пробирку, тщательно перемешивают ее содержимое. Для завершения реакции смеси дают постоять не менее пяти минут.
Специальной пипеткой прибавляют к смеси по каплям дистиллированную воду, перемешивая содержимое палочкой. Это продолжается до тех пор, пока цвет исследуемой жидкости не сравняется с окраской стандартного раствора.
Отмечают по шкале, на каком делении стоит уровень верхнего края мениска, полученного раствора солянокислого гематина. Если по шкале пробирки единица измерения Hb г%, то, чтобы выразить результат в системе СИ, умножают найденную цифру на 10. Например, Hb = 13,2 г% 10 = 132 г/л.
Источниками ошибок могут быть: выцветшие стандартные растворы в старых гемометрах; неточное соблюдение пятиминутной выдержки перед началом разведения; попадание воздуха в капилляр с кровью.
Оформление протокола. Назвать принцип метода определения количества Hb, отметить чем разводится кровь и почему. Записать найденное количество гемоглобина и нормальное содержание гемоглобина у мужчин и женщин (у детей); зарисовать гемометр Сали и капилляр для взятия крови.
Вывод. Сравнить полученные результаты с нормой, указать соответствует ли норме найденное количество гемоглобина.