БХ методички 2 курс / Metodichki / методы / биохимия крови

дисмутацию супероксидных радикалов осуществляют в основном ферменты - супероксиддисмутазы (СОД), а в жидких средах организма и, в первую очередь, плазмы крови супероксид перехватывающую активность проявляют низкомолекулярные соединения: комплексы меди и цинка с ароматическими аминокислотами, пептидами, средне- и длиноцепочечные жирные кислоты, мочевая кислота, катехоламины, кортикостероиды, аскорбиновая кислота, токоферолы, а также ряд тканеспецифических веществ меланин кожи, билирубин крови и т.д.).

Однако известно, что запасы в организме человека неферментативных оксидантов невелики и при взаимодействии со свободными радикалами они сами могут превращаться в свободнорадикальные формы, т.к. механизм их действия основан на способности отдавать электрон свободным радикалам, превращая их в более устойчивые соединения.

Неферментные антиоксиданты могут отдавать электрон ионам металлов переходной валентности (Fe2+, Cu2+, Zn2+, Mn+), входящих в хромопротеины и способные высвобождать восстановленные формы этих металлов из протеидных комплексов.

Ферментные антиоксиданты обладают значительным преимуществом перед неферментными за счёт большей нейтрализующей мощности, способности к регенерации и субстратной индукции. Среди ферментных систем АОС выделяют три основных системы:

1.СОД,

2.каталаза,

3.глутатионпероксидаза.

СОД играет ключевую роль в нейтрализации продуктов СРО. Различают несколько видов СОД, в зависимости от металла, входящего в его ферментный центр: Cu, Zn, Mn-СОД, являются внутриклеточными ферментами, в незначительном количестве в митохондриях может присутствовать Fe-СОД, выделяют также эктрацеллюлярную СОД (Э-СОД). Э-СОД наиболее активна в лёгких, где синтезируется альвеолярными пневмоцитами. Кроме того, Э-СОД найдена в сыворотке, синовиальной жидкости, спинномозговой жидкости, в тканях организма, где на 99% Э-СОД присутствует в интерстициальной жидкости и только 1% связан с

72

клеточными мембранами. В сосудах Э-СОД синтезируется в основном гладкомышечными клетками. Антиоксидантная активность СОД связана с её способностью одновалентно восстанавливать супероксидрадикал до перекиси водорода в

реакциях:

СОД-Cu2+ + О2 ¯ —> СОДCu + + О2 СОД-Cu¯ + О2 ¯ +2Н + —> СОДCu2+ + Н2О2 СОД-Mn3+ + О2 ¯ —> СОДMn2+ +Н2О2 СОД-Mn2+ + О2 ¯ +2Н + —> СОДMn3+ + Н2О2

Считается, что активность Mn-СОД в 1,5-2 раза ниже, чем Cu, Zn-СОД.

Другим ферментом, участвующим в восстановлении АМК, в частности Н2О2 является каталаза, которая катализирует

восстановление перекиси в следующей реакции: КаталазаFe3+ + Н2О2 —> Комплекс-1(Fe5+)

Комплекс-1(Fe5+) + Н2О2 —> КаталазаFe3+ + 2Н2О + О2 Глутатионпероксидаза (ГП), существует в нескольких видах в

зависимости от её присутствия в тканях. Различают эритроцитарную

глутатионредутазы (2):

(1)Н2О2 + 2GSH —> 2Н2О +GSSG ROOH + 2GSH —> ROH +2GSSG +H2O

(2)GSSG +NADPH + H+ —> 2GSH +NADP+

АОС каждого человека индивидуальна и зависит от генетического кода, заложенного в генах каждого отдельного организма. Известно, что у человека ген, кодирующий СОД 1 расположен в 21-ой хромосоме, СОД 2 в 6-ой хромосоме, СОД 3 в 4- ой, ген каталазы в 11-ой, ген ГП1 в 14-ой. Существует ряд заболеваний, при которых отсутствие синтеза какого-либо из ферментов или его недостаточность играет ключевую роль в развитии патологии, к таким заболеваниям относятся - болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, латеральный амиотрофический склероз и др.

Индукторами синтеза антиоксидантов могут выступать непосредственно АМК, а также некоторые продукты ПОЛ, особенно при влияние негативных внешних факторов.

73

Доказано, что повышение уровня продуктов свободнорадикального окисления (диеновых и триеновых конъюгатов, малонового диальдегида) и снижение активности антиоксидантных ферментов – каталазы и глутатионредуктазы связана с дисбалансом между адаптивным потенциалом интрацеллюлярных энзимов АОС и активностью свободно-радикальных процессов.

Диагностика окислительного повреждения тканей

1.Определение концентрации окислителей (прооксидантов) в составе биологических жидкостей

2.Определение концентрации антиоксидантов в составе биологических жидкостей

3.Определение содержания продуктов перекисного окисления:

-липидов (диеновые и триеновые конъюгаты, малоновый диальдегид)

-белков (SH – группы белков плазмы)

-ДНК.

РазделIII. Лабораторная диагностика

Для проведения лабораторных исследований можно использовать различные компоненты крови в т.ч. плазму и сыворотку крови, эритроцитарную массу, тромбоцитарную массу, лейковзвесь, цельную кровь.

I. ОБЩИЙ АНАЛИЗ КРОВИ

Диагностическое значение общего анализа крови

диагностических методов, позволяющий судить о реакции кроветворных органов на различные патологические и физиологические процессы, происходящие в организме человека. Общий анализ крови играет большую роль в постановке диагноза, и оценке динамики процесса, а также позволяет прогнозировать особенности протекания различных патологических и физиологических процессов у каждого пациента.

Общий анализ крови включает:

1.определение количества зрелых эритроцитов и ретикулоцитов,

2.концентрации гемоглобина,

3.подсчёт лейкоцитов, определение лейкоцитарной формулы

4.тромбоцитов,

5.величины гематокрита,

6.эритроцитарных и тромбоцитарных индексов.

Детальный, информативный общий анализ крови может быть получен при измерении образцов венозной или капиллярной крови (этот факт необходимо учитывать при оценке полученных результатов), на современных автоматизированных гематологических анализаторах с использованием высокачественных реагентов.

Одним из наиболее современных и высокочувствительных анализаторов является автоматизированный гематологический анализатор МЕК-6400J/K.

Автоматизированный гематологический анализатор МЕК6400J/K предназначен для одновременного измерения 18 параметров. Параметр WBC разделяется на три параметра: лимфоциты, моноциты и гранулоциты. WBC, RBC и PLT измеряются по методу обнаружения электрического сопротивления.

Анализатор позволяет проводить быстрый подсчет, и все операции выполняются автоматически. Вам нужно лишь поместить пробозаборник в контейнер для образца, в котором содержится цельная кровь и нажать на переключатель [Count]. Результаты и данные выводятся на цветном ЖКД. Анализатор также оснащен блоком прокола крышек, при помощи которого образец в тубе с крышкой может быть измерен в закрытом режиме.

Анализатор автоматически очищает оставшуюся кровь из пробозаборника, поэтому он безопасен в работе и отсутствует риск

75

контакта с кровью. Анализатор имеет функцию самопроверки, контроля качества и прочие программы для получения надежной системы управления данными.

Технические характеристики и программное обеспечение прибора позволяют выполнить детальный высокоспециализированный анализ с учётом индивидуальных особенностей пациента, для этого перед началом измерения в память прибора вводятся следующие параметры: пол, возраст пациента.

76

Забор пробы

Забор материала производится в специализированные вакуумные тубы для образцов крови, которые содержат 2 мл антикоагулянта

EDTA-2K..

Режим разведения

Существует пять режимов разведения: нормальный, предварительного разведения, низкого разведения, высокого разведения и очень высокого разведения. Для режимов измерения крови с предварительным разведением, вы можете указать объем крови для предварительного разведения (10 мкл или 20 мкл) на экране MEASUREMENT из экрана SETTINGS. Пользуйтесь пунктом “Изменение установок для измерения” в Разделе 3. В нормальном режиме разведения измеряется образец объемом 30 мкл.

Когда WBC образца крови кажется высоким, образец может быть измерен в режиме высокого или более высокого разведения. В режиме высокого разведения, образец крови объемом 10 мкл всасывается и разводится в пропорции втрое большей обычной пропорции разведения. В режиме более высокого разведения, 5 мкл образца крови всасывается и разводится в пропорции, в шесть раз большей обычной пропорции разведения.

Когда WBC или PLT образца крови кажутся низкими, образец может быть измерен в режиме низкого разведения, при котором 55 мкл крови образца всасывается и разводится в пропорции, вдвое меньшей обычной пропорции разведения.

Тип образца

При работе с этим анализатором вы можете указать тип образца перед каждым измерением. Это позволит вам присвоить другой нормальный диапазон различным образцам или восстановить указанные данные.

Одинарный и двойной подсчет

В режиме одиночного подсчета, подсчет каждого образца производится один раз.

77

В режиме двойного подсчета анализатор автоматически производит подсчет образца дважды, выводит и сохраняет среднее значение. Распечатывается только среднее значение, которое выводится и хранится в памяти. При наличии серьезных отклонений (более 10%) между показаниями двух подсчетов, автоматически выполняется третий подсчет и используется среднее значение двух самых близких по значениям подсчетов.

При выводе или распечатке гистограмм образца, подсчет которого производился дважды, данные первого подсчета распечатываются для WBC, а данные второго подсчета распечатываются для RBC и PLT.

Вывод сигнала тревоги

Анализатор автоматически пересчитывает образец до трех раз, если при измерении сработает сигнализация. Если результаты измерения все еще непригодны после 3 подсчетов, анализатор выводит сигнал тревоги с результатами измерений.

Хранение данных

Анализатор сохраняет все измеренные и вычисленные данные для последних 400 образцов и гистограмм для 50 образцов. После чего данные самых старых измерений удаляются, когда измеряется новый образец.

Если вам нужно сохранить данные, пользуйтесь режимом автоматической печати для сохранения данных в виде распечатки, особенно гистограммы.

Данные контроля качества (и CV), а также данные калибровки также сохраняются.

Пересчет PLT

Анализатор автоматически производит пересчет образца, когда показатель PLT чрезвычайно низкий. Происходит пересчет RBC, HCT, PLT, MCV, PCT, MCH, MCHC и RDW. Вы можете установить порог, при котором происходит пересчет образца. Пользуйтесь пунктом “Изменение установок измерений” в Разделе 3. При нормальной работе выберите 100,000/мкл.

78

Пересчет при попадании в критический диапазон

Анализатор может быть установлен на вывод сообщения о пересчете образца, когда при подсчете любого параметра значения находятся вне измеряемого диапазона анализатора (называемого критическим диапазоном). Когда поле <Recount if panic value> установлено на “Yes” на экране MEASUREMENT экрана SETTINGS, а результаты измерений находятся вне критического диапазона, появляется сообщение, запрашивающее о необходимости повторного пересчета образца в другом режиме разведения.

При выборе необходимости повторного измерения и когда результаты измерений находятся ниже критического диапазона (рядом с параметром появляется символ “L”), пересчет образца происходит в режиме низкого разведения. Когда результатом измерения является “OVER”, рядом с параметром появляется символ “!” или сообщение с кодом тревоги А031, А032 (WBC шум), пересчет образца происходит в режиме высокого разведения. При выборе для поля <High dilute mode for panic value recount> значения “High” на экране MEASUREMENT экрана SETTINGS, образец разводится в пропорции втрое большей обычной пропорции для разведения. При выборе “Higher”, образец разводится в пропорции, в шесть раз большей обычной пропорции для разведения. При выборе “High”, происходит пересчет при установке “High”. Если результат WBC все еще высокий, происходит еще один пересчет при установке “Higher”. Для изменения установок пересчета, пользуйтесь пунктом “Изменение установок измерения” в Разделе 3.

Пересчет с высоким/низким разведением недоступен для образцов в режиме предварительного разведения.

Пересчет образцов в особых случаях

Подсчет WBC

Для измерения образца крови у пациента с серьезной гепатопатией, может оказаться необходимым пользоваться методом, отличным от пересчета кровяных клеток. Это связано с увеличением сопротивления мембраны RBC в отношении лизирующего реагента (недостаточное гемолизирование) и вызовет увеличение подсчета WBC при проведении измерения крови методом пересчета кровяных клеток “!” появляется рядом с результатами подсчета WBC.

79

Подсчет PLT

Подсчет PLT может быть снижен из-за псевдотромбоцитопении или неквалифицированного выполнения процедуры взятия крови. Рекомендуется делать образец крови и наблюдать его в микроскоп, когда показатель PLT падает ниже 50,000/мкл.

ОСТОРОЖНО

В качестве антикоагулянта пользуйтесь только EDTA (этилендиамин тетра-уксусная кислота). Не пользуйтесь гепарином в качестве антикоагулянта. Он воздействует на белые кровяные клетки и измерение тромбоцитов.

ПРИМЕЧАНИЕ

Убедитесь, что объем образца находится в интервале 1.0 – 2.0 мл. Для получения надежных данных, проведите измерение образца крови в течение 8 часов. Если образец крови хранится при комнатной температуре более 8 часов, сопротивление мембран белых кровяных клеток в отношении лизирующего реагента снижается и белые кровяные клетки будут сжиматься сильнее (уменьшение объема клеток) сразу после добавления лизирующего реагента к разведенному образцу. Это приведет к общему

снижению показателей подсчета WBC.

Держите образцы крови при комнатной температуре. Не держите их в холодильнике.

Когда измерение не может быть выполнено правильно из-за плохой гемолизации, проведите измерение образцов крови в течение как минимум 30 минут после сбора.

Если образцы крови не могут быть измерены в течение 30 минут после сбора, признаки ошибочных результатов могут усилиться.

Осторожно и тщательно взболтайте образец крови снова после измерения.

Не взбалтывайте образец слишком сильно, поскольку образуются ненужные пузыри и происходит гемолизация.

Не пользуйтесь агрегированной или коагулированной кровью. В противном случае анализатор может получить повреждения.

80

Вытрите кровь с крышки образца при повторном подсчете того же образца.

При завершении измерения, данные измерения сохраняются в памяти, а цифровые результаты и гистограмма появляются на экране. Подробности по экрану RESULTS смотри в разделе “Интерпретация экрана RESULTS”. (Формат вывода изменяется в соответствии с установками.)

Измерение в режиме разведения Low/High

Когда показатели WBC образца крови кажутся высокими, образец может быть измерен в режиме разведения “High”. В режиме разведения “High”, 10 мкл образца крови всасывается и разводится в пропорции, втрое большей обычной пропорции разведения. В режиме разведения “Higher”, 5 мкл образца крови всасывается и разводится в пропорции, в шесть раз большей обычной пропорции для разведения.

Когда WBC или PLT образца крови кажутся низкими, образец может быть измерен в режиме низкого разведения, при котором 55 мкл образца крови всасывается и разводится в пропорции, вдвое меньшей обычной пропорции.

При завершении измерения, данные измерений сохраняются в памяти и на экране появляются цифровые результаты и гистограмма. Подробности по экрану RESULTS смотри раздел “Интерпретация экрана RESULTS”. (Формат вывода изменяется в соответствии с установками).

Измерения в открытом режиме

ОПАСНО

Всегда носите резиновые перчатки для защиты от инфекций при работе и проведении измерений образцов крови.