1.Микробиология и исторические этапы ее развития. Микробиология (от греч. micros - малый, bios- жизнь, logos- учение, т.е. учение о малых формах жизни) — наука, изучающая организмы, неразличимые (невидимые) невооруженным какой - либо оптикой глазом, которые за свои микроскопические размеры называют микроорганизмы (микробы).

Предметом изучения микробиологии является их морфология, физиология, генетика, систематика, экология и взаимоотношения с другими формами жизни.

В таксономическом отношении микроорганизмы очень разнообразны. Они включают прионы, вирусы, бактерии, водоросли, грибы, простейшие и даже микроскопические многоклеточные животные.

По наличию и строению клеток вся живая природа может быть разделена на прокариоты (не имеющие истинного ядра), эукариоты (имеющие ядро) и не имеющие клеточного строения формы жизни. Последние для своего существования нуждаются в клетках, т.е. являются внутриклеточными формами жизни.

Основные этапы развития микробиологии. К ним можно отнести следующие:

1.Эмпирических знаний ( до изобретения микроскопов и их применения для изучения микромира).

2.Морфологический период занял около двухсот лет.

3.Физиологический период (с 1875г.)- эпоха Л.Пастера и Р.Коха.

4.Иммунологический период.

5. Следующим важным этапом в развитии микробиологии стало открытие антибиотиков.

6. Современный молекулярно - генетический этап развития микробиологии, начался во второй половине 20 века в связи с достижениями генетики и молекулярной биологии, созданием электронного микроскопа.

7.Перспективы развития. На пороге 21 века микробиология представляет одно из ведущих направлений биологии и медицины, интенсивно развивающееся и расширяющее границы человеческих знаний

С помощью микроорганизмов осуществляются важные производственные процессы — хлебопечение, виноделие и пивоварение, производство органических кислот, ферментов, пищевых белков, гормонов, антибиотиков и других лекарственных препаратов.

3. Значение мкб контроля. Микробиологический контроль на пищевых производствах представляет собой все методы исследования и контроля, связанные с определением степени бактериальной обсеменённости контролируемого объекта, а также методы количественного учёта микрофлоры.

Микробиологический контроль охватывает все этапы цикла жизни пищевого продукта: начиная с сырья и упаковочных материалов, далее по всем ключевым точкам технологического процесса, включая момент выпуска в реализацию; и вплоть до конца срока хранения.

Мир микроорганизмов многочислен и разнообразен. Они повсеместно распространены в природе : в почве, водоемах, воздухе, находятся на продуктах питания и на всех предметах, окружающих человека.

Микроорганизмы выполняют колоссальную по значимости биохимическую работу. Они разлагают растительные и животные остатки на поверхности планеты; используются в технологии производства многих пищевых продуктов, различных биологически активных соединений (например, витаминов, антибиотиков), в генной инженерии, а также различных отраслях народного хозяйства.

Однако многие микроорганизмы наносят большой ущерб народному хозяйству, вызывая порчу продуктов сельскохозяйственного и промышленного производства.

Среди микроорганизмов есть особая группа – патогенные микроорганизмы, которые вызывают заболевания человека, животных, растений.

На современном этапе развития народного хозяйства страны, в условиях ускорения научно-технического прогресса, еще в большей степени возрастает роль микробиологической науки. В настоящее время микробиология дифференцирована на ряд самостоятельных дисциплин : общая, медицинская, сельскохозяйственная, ветеринарная, техническая (промышленная) и другие. Одним из разделов технической микробиологии является пищевая микробиология.

Без знания микрофлоры пищевых продуктов, специфических свойств микроорганизмов, их биохимической деятельности, зависимости развития от окружающей среды нельзя успешно выполнить задачи, поставленные перед наукой и практикой в области контроля качества, производства, хранения, реализации пищевых продуктов и максимального сокращения их потерь.

Значение :вопросам обеспечения мкб безопасности качеству ПП уделяется особое внимание, т.к. это основа- гарантии безопасности потребителя; сокращение потерь с/х сырья и готовой продукции; повышения эффективности производства;повышение конкурентноспособности продукции.

Предмет.-строение и морфологические свойства м/о;физиологические и культуральные признаки м/о; закономерности жизнедеятельности м/о,роста,размножения и гибели;методы выделения,идентификации,количественного учета м/о;методы органолептического анализа качества ПП;организация и проведение санитарно-микробиологической экспертизы ПП;

Задачи.-дать общеобразовательные знания о м/о, особенностях их жизнедеятельности, отличительных морфологических, культуральных,физиологических признаках, необходимых для анализа ПП; дать профессиональные навыки работы с м/о,познакомится со способами их выделения,идентификации и учета в ПП; познакомить с организацией МКБ контроля на производстве правилами проведения санитарно-гигиенической экспертизы.

4.Размещение МКБ лаборатории. Работу с клеточными культурами проводят в специализированной лаборатории, оснащенной необходимым оборудованием, лабораторной посудой и др. средствами. Одним из главных условий при культивировании клеток является обеспечение стерильности на всех этапах работы, предотвращение возможной контаминации вирусами, бактериями, микоплазмами и грибами. Лаборатория должна располагать боксовыми помещениями, предназначенными для проведения работ в стерильных условиях.  Для создания локального стерильного объема, требуемого для работы и обеспечивающего биологическую защиту исследователя, в боксовом помещении нужен ламинар-бокс. Ламинары, как и боксы должны быть оснащены бактерицидными лампами, которые включают на 30-40 мин. перед началом работы, в обеденный перерыв и в конце рабочего дня. Входить в бокс разрешается только в специально предназначенной одежде и обуви, причем халаты, маски и шапочки должны быть предварительно простерилизованы автоклавированием при 0,7 атм. в течение 1 часа. Во время работы в боксе всю использованную посуду, резиновые и ватно-марлевые пробки, бумагу и др. материалы своевременно убирают в контейнер. Загрязненные поверхности протирают стерильной салфеткой (ватой), смоченной спиртом и прожигают. В конце рабочего дня проводят влажную уборку ламинара и бокса с 10% раствором хлорамина или любым другим асептическим раствором, предусмотренным Санитарными Правилами.

Стерильность боксов контролируют путем подсчета колоний микроорганизмов на плотных микробиологических средах МПА, Сабуро после 10 мин. выдерживания открытых чашек Петри. Отсутствие роста колоний в начале рабочего дня и рост 1 - 15 в конце работы свидетельствуют о достаточной чистоте помещений. При более массовом бактериальном загрязнении боксы подвергают дезинфекции распылением смеси, состоящей из КМnО4 с формалином. 

Работу в боксе проводят у пламени газовой горелки или спиртовки (не использовать спирт-денатурат). Горлышки всех флаконов и матрасов с питательными средами, сывороткой, растворами или клеточными культурами обжигают тампоном, смоченным в спирте, пробки прожигают в спирте. 

Все используемые в работе материалы должны быть стерильными и не оказывать токсического действия на клетки.

Стеклянную посуду, резиновые изделия, инструменты моют, стерилизуют по методам, описанным в руководствах .

Требования к обеззараживанию материала и уборке помещений, предусмотренные Санитарными Правилами «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности и гельминтами»:

-дезинфекцию различных объектов при работе с ПБА III-IV групп патогенности проводят в соответствии с Санитарными Правилами [3];

-методы и средства обеззараживания определяются в каждом отдельном случае в зависимости от вида ПБА и характера обеззараживаемого материала;

-в лаборатории должен храниться как минимум недельный запас дезинфицирующих средств;

-вновь поступающие на склад серии дезинфицирующих средств необходимо контролировать на содержание действующего вещества;

-дезинфицирующие растворы готовит лаборант или дезинфектор; на емкости с дезинфицирующим раствором должно быть указано его название, концентрация и дата приготовления;

-автоклавирование производится персоналом, имеющим свидетельство об окончании специальных курсов; при наличии централизованной автоклавной ответственность за обеззараживание несет заведующий автоклавной;

- контроль работы автоклавов осуществляют в соответствии с требованиями действующего законодательства и Санитарных Правил [3];

-перенос материала для обеззараживания внутри подразделения производится в специальных емкостях (баках, ведрах, биксах с крышками);

- текущая уборка помещений проводится ежедневно влажным способом после окончания рабочего дня: в "чистой" зоне лаборатории с применением моющих средств, в "заразной" зоне с применением дезинфектантов;

-уборочный инвентарь должен быть промаркирован отдельнодля "чистой" и "заразной" зон; перенос его из зоны в зону не допускается;

-в боксовых помещениях должна проводиться еженедельная генеральная уборка с применением дезинфицирующих средств путем протирания поверхности мебели, приборов, аппаратов, а также стен (на высоту до 2 метров); после влажной уборки включают бактерицидные лампы;

- стеклянные поверхности бактерицидных ламп следует протирать ветошью, смоченной спиртом, не реже 1 раза в неделю.

5.Оборудование и используемый инструментарий в микробиологической лаборатории.

В микробиологической лаборатории проводится контроль качества и безопасности продукции по микробиологическим показателям. Основным направлением деятельности лаборатории является микробиологический контроль качества (стерильность или микробиологическая чистота) готовых изделий, сырья и упаковочных материалов, используемых при производстве пищевых продуктов.   В соответствии с установившейся лабораторной практикой всю аппаратуру и оборудование содержат в чистоте и в хорошем рабочем состоянии. Перед использованием оборудование следует проверить в соответствии с инструкцией. Оборудование регулярно проверяют и проводят сервисное обслуживание, чтобы обеспечить безопасность и пригодность его к использованию. Оборудование проверяют согласно рабочим условиям и точности.        Частота калибровки и проверок каждой единицы оборудования в большинстве случаев должна определяться каждой лабораторией в зависимости от типа оборудования и уровня активности лаборатории и в соответствии с инструкциями изготовителя оборудования.       Аппаратуру и оборудование следует сконструировать и установить таким образом, чтобы облегчить работу персоналу и обеспечить выполнение технического обслуживания, очистки, дезактивации и калибровки.

Бокс биологической безопасности для микробиологических исследований.     Бокс биологической безопасности для микробиологических исследований (далее бокс) - это рабочее помещение, оснащенное установкой для горизонтального и вертикального ламинарных потоков воздуха, предназначенной для удаления пыли и других частиц из воздуха, в том числе микробов. Кабинеты для использования в лабораториях микробиологии пищевых продуктов разделяются на четыре типа: a) Боксы биологической безопасности класса I - это открытые спереди безопасные вытяжные шкафы, защищающие оператора и окружающую среду. b) Боксы биологической безопасности класса II защищают образец, оператора и окружающую среду. c) Ламинарные боксы с горизонтальным оттоком воздуха защищают работу от загрязнения, но выносят любые аэрозоли на лицо оператора. d) Ламинарные кабинеты с вертикальным потоком воздуха защищают продукт при помощи вертикального ламинарного потока воздуха.

Очистка и дезинфекции. Рабочую зону очищают и обеззараживают после использования с помощью соответствующего, не обладающего коррозийными свойствами дезинфицирующего средства, руководствуясь инструкцией изготовителя. Регулярно обследуют защитные предфильтры проволочных сеток и вытирают их чистой, пропитанной дезинфицирующим средством тканью.

Техническое обслуживание и контроль.Необходимо использовать боксы биологической безопасности, которые предназначены для применения в лаборатории в соответствии с существующей окружающей средой. Квалифицированный оператор должен проверять эффективность бокса биологической безопасности при получении и затем с регулярными интервалами, как рекомендует изготовитель, а также после любого ремонта или модификации.    Следует периодически выполнять проверку чистоты рабочей поверхности и стен бокса от любого микробного загрязнения.

Весы и гравиметрические разбавители Весы используют для взвешивания испытуемой пробы, компонентов питательных сред и реактивов.     Гравиметрические разбавители - это электронные инструменты, состоящие из весов и программируемого дозатора жидкости, который применяют для приготовления исходных суспензий проб. Гомогенизаторы, смесители и миксеры Это оборудование используется для получения исходной суспензии из испытуемой пробы для анализа нежидких продуктов. Необходимо использовать следующую аппаратуру:

     - перистальтический смеситель (stomacher) со стерильными пакетами,

     - ротационный гомогенизатор (блендер);

     - вибрационный миксер (вибратор) со стерильными пакетами;

pH-метр применяют для измерения при определенной температуре разности потенциалов между измеряющим электродом и электродом сравнения, погруженными в продукт. pH-метр должен обеспечивать измерение с точностью до ±0,05 единицы pH.pH-метр должен быть оснащен ручным или автоматическим определителем температуры Использование      pH-метр используют для измерения значения pH питательных сред и реактивов, а также для проверки их качества после стерилизации.

Автоклав позволяет поддерживать в камере температуру насыщенного пара и используется для уничтожения (умерщвления) микроорганизмов. Автоклав должен быть оснащен:        - как минимум, одним предохранительным клапаном,     - сливным краном,    - регулятором температуры для поддержания необходимой температуры в камере в пределах ±3 °C (с учетом неопределенности измерения, связанной с измерительной термопарой),     - температурным датчиком или регистрирующим термоэлементом. 

Аппарат для приготовления питательных сред разработан преимущественно для стерилизации больших объемов сред. Он состоит из нагревающегося сосуда, водяной рубашки и устройства непрерывного перемешивания. Оборудование должно быть оснащено термометром, манометром, таймером и предохранительным клапаном.

Термостат (инкубатор)  состоит из изолированной камеры, которая позволяет удерживать постоянство температуры, однородно распределенной в камере в пределах максимально допустимой температурной ошибки, указанной в методе испытания 

Холодильник, холодная комната (помещение для хранения на холоде)представляют собой камеры, которые позволяют поддерживать хранение при пониженной температуре     Загрузку холодильников, холодных камер и холодных комнат проводят таким образом, чтобы поддерживалась необходимая циркуляция воздуха и возможность перекрестного заражения была сведена к минимуму.

Баня термостатическая контролируемая заполненная жидкостью, с подогнанной крышкой или без нее или другим устройством, ограничивающим испарение, которое требуется, чтобы поддерживать необходимую температуру. баню используют для:     - инкубации при постоянной температуре засеянных питательных сред;     - поддержания стерильных расплавленных агаровых сред при приготовлении сред;    - поддержания температуры стерильных расплавленных агаровых сред для использования в определенных методах;   - приготовления первичных образцов суспензий или растворов при контролируемой температуре;   - обработки нагреванием первичных образцов суспензии при контролируемой температуре.

Стерилизационный сушильный шкаф- это камера, которая способна поддерживать температуру от 160 °C до 180 °C для уничтожения (разрушения) микроорганизмов с помощью сухого горячего воздуха.

Дозатор (устройство для разливки) питательных сред и реактивов       Дозатор - это инструмент или устройство, используемое для дозированной разливки питательных сред и реактивов в пробирки, флаконы или чашки Петри.

Устройство для подсчета колоний     Ручные устройства подсчета колонии используют счетное устройство, приводимое в действие под давлением, и обычно дающее звуковой сигнал каждой единицы счета и цифровую индикацию общего количества колоний.

Центрифуга- это механические устройства, в том числе управляемые с помощью электроники, которые используют центробежную силу для отделения взвешенных частиц, включая микроорганизмы, от жидкостей.

    

6.ТБ в лаборатории. Правила техники безопасности при работе в микробиологической лаборатории установлены в Санитарных Правилах СП 17-129 РБ 2000.

Правила техники безопасности в микробиологической лаборатории предусматривают:

-работу с ПБА III-IY групп патогенности выполняют специалисты с высшим и средним специальным образованием, в соответствии с принятым каждым ведомством порядком замещения должностей, прошедшие соответствующую подготовку;

- персонал допускается к работе с ПБА только после проведения инструктажа по соблюдению требований биологической безопасности; последующие инструктажи проводятся не реже 2 раз в год; поименный допуск специалистов к работе с ПБА III-IY групп патогенности оформляется приказом руководителя учреждения;

- посторонние лица в лабораторию не допускаются;

- посещение "заразной" зоны лаборатории инженерно-техническим персоналом осуществляется с разрешения руководителя подразделения в сопровождении сотрудника лаборатории; все ремонтно-технические работы проводятся после окончания работы с ПБА и проведения дезинфекционных мероприятий;

- в лабораториях, работающих с ПБА III-IY групп патогенности должны быть: план-схема лаборатории и прилегающих помещений в масштабе 1:100 с обозначением дверей и окон, назначения помещений и их площади, расстановкой лабораторного и бытового оборудования и мебели, указанием путей движения патогенного материала инструкция по охране труда при работе с ПБА III-IY патогенности;

- должностные инструкции на специалистов, утвержденные руководителем лаборатории (учреждения); журнал регистрации инструктажа на рабочем месте;

- помещения лаборатории должны использоваться по своему прямому назначению, в них запрещается проводить работы, не связанные с выполнением служебных обязанностей;

- доставка в лабораторию материала для исследования осуществляется в специальных контейнерах, биксах или сумках-холодильниках; доставляемые емкости с жидким материалом должны быть закрыты резиновыми или пластмассовыми пробками, исключающими выливание содержимого во время транспортирования; дно контейнеров, содержащих емкости с ПБА должно быть покрыто адсорбирующим материалом (марлевая салфетка, ткань, вата и прочее); не допускается доставка материала в хозяйственных сумках, чемоданах, портфелях и других предметах личного пользования;

- прием и разборка материала, доставленного на исследование, проводится с соблюдением мер предосторожности; персонал диагностических лабораторий должен использовать маску и резиновые перчатки; емкости с ПБА помещаются на поднос или лоток, покрытый многослойной марлевой салфеткой, смоченной дезинфицирующим раствором;

- во время работы двери боксов и предбоксников должны быть закрыты; выход из бокса во время проведения работы запрещается; бокс должен быть оснащен средствами сигнализации на случай аварии;

- при пипетировании необходимо пользоваться только резиновыми грушами или автоматическими устройствами; пипетирование ртом в лабораториях строго запрещено;

- бактериологическая петля должна быть замкнута в непрерывное кольцо и иметь плечо длиной не более 6 см;

- перед использованием посуда, пипетки, оборудование, шприцы должны быть проверены на целостность и исправность;

- во время работы все инструменты, имевшие контакт с ПБА III-IY групп патогенности, фламбируются в пламени горелки или сбрасываются в емкости с дезинфицирующим раствором или специальные емкости для последующего обеззараживания; все емкости для обеззараживания ПБА III-IY групп патогенности, должны быть промаркированы; автоклавирование проводится персоналом, имеющим свидетельство об окончании специальных курсов;

- работы по автоклавированию ПБА III-IY групп патогенности, стерилизации питательных сред и лабораторной посуды, производящиеся в одном помещении (автоклавной), должны быть разделены во времени;

- по окончанию работы все объекты, содержащие ПБА, должны быть убраны в хранилища (холодильники, термостаты, шкафы); в обязательном порядке производится дезинфекция рабочих поверхностей столов;

- рабочий стол по окончанию работ с ПБА III-IY групп патогенности, обрабатывается дезинфицирующим раствором или 70-ти процентным спиртом, или фламбируется горящим факелом;

- в случае аварии во время работы с ПБА III-IY групп патогенности проводятся организационные и дезинфекционные мероприятия в соответствии с действующим законодательством;

- использованные пипетки полностью (вертикально) погружаются в дезинфицирующий раствор, избегая образования в каналах пузырьков воздуха;

- перенос ПБА и использованной посуды для обеззараживания должен осуществляться в закрывающихся емкостях, исключающих инфицирование во время транспортировки;

- по окончании отдельных этапов исследования персонал обязан обработать руки 70-ти процентным раствором спирта и вымыть руки с мылом; по окончании рабочей смены следует обработать и вымыть руки, снять специальную одежду и снова вымыть руки; запрещается выходить из рабочих помещений в специальной одежде;

- после завершения работы лаборатория запирается и опечатывается;

- правила внутреннего распорядка лабораторий должны составляться на основании настоящих Правил и утверждаться руководителем учреждения;

- прием посетителей, хранение пищевых продуктов, прием пищи разрешается только в специально отведенных местах в "чистой" зоне лаборатории;

- вынос из лаборатории оборудования, лабораторной или хозяйственной посуды, реактивов, инструментов и других предметов производится только после их дезинфекции и с разрешения руководителя;

- использование материалов и средств личной гигиены, раздражающих кожу, запрещается;

- в "заразной" зоне лаборатории запрещается: оставлять после окончания работы на рабочих местах нефиксированные мазки или посуду с ПБА; пипетировать ртом, переливать жидкий инфекционный материал через край сосуда; хранить верхнюю одежду, головные уборы, обувь, зонты, хозяйственные сумки, косметику, а также продукты питания; курить, пить воду, принимать пищу; оставлять без надзора рабочее место во время выполнения любого вида работ с ПБА; сливать жидкие отходы в канализацию без предварительного обеззараживания; содержать и выращивать цветы в вазонах;

- при появлении у сотрудника симптомов, характерных для инфекционного заболевания, вызываемого возбудителем, с которым он работал, сотрудник обязан поставить в известность руководителя лаборатории.

Детям вход в лабораторию запрещен.

Должны проводиться текущая дезинсекция и дератизация лабораторных помещений.

Необходимо обязательно немедленно сообщать руководителю лаборатории обо всех аварийных ситуациях, создающих угрозу биологической безопасности, и немедленно проводить все медицинские мероприятия для предотвращения последствий аварий.

В лаборатории должна быть инструкция по технике безопасности, которую персонал должен знать и строго выполнять и периодически сдавать зачет, подтверждающий знание этой инструкции

7. Питательные среды. Питательные среды являются основой микробиологической работы, и их качество нередко определяет результаты всего исследования. Среды должны создавать оптимальные (наилучшие) условия для жизнедеятельности микробов.

Питательные среды классифицируют по консистенции — жидкие, полужидкие, плотные (твердые); по происхождению — животные, растительные, синтетические (приготовлены из определенных химически чистых соединений в точно указанных концентрациях); по назначению — общеупотребительные (универсальные), дифференциальные, селективные и среды обогащения, специальные.

Обычные (простые) среды. Пригодны для культивирования многих видов патогенных и непатогенных бактерий. К ним относят мясопептонный бульон (МПБ), мясопептонный агар (МПА), мясопептонный желатин (МПЖ). Мясопептонный агар готовят из мясопептонного бульона путем добавления 1...2 % агар-агара, который придает питательной среде при охлаждении консистенцию плотного студня. Получают агар из некоторых видов водорослей.

Дифференциальные среды. Служат для идентификации бактерии разных видов и родов по их культуральным и биохимическим свойствам. К ним относят мясопептонный желатин, среды Гисса, Эндо, кровяной агар, бактоагар Плоскирева (бактоагар Ж) и др.

Элективные (избирательные) среды и среды обогащения. Благоприятствуют размножению бактерий определенных видов и подавляют рост других микробов. К ним относят яичные среды Петраньяни, Гельберга для выращивания микобактерий туберкулеза, среды Дюба — Смита в модификации А. П. Аликаевой для выращивания возбудителя паратуберкулеза и др.

Специальные среды. Наиболее оптимальные для выращивания бактерий, не размножающихся на общеупотребительных средах. К ним относят кровяной агар, сывороточный агар, сывороточный бульон, среда Китта—Тароцци (МППБ), среда Сабуро и др.

Требования, предъявляемые к питательным средам:

1) быть питательными, т. е. содержать в легко усвояемом виде все вещества, необходимые для удовлетворения пищевых и энергетических потребностей. Ими являются источники органогенов и минеральных (неорганических) веществ, включая микроэлементы. Минеральные вещества не только входят в структуру клетки и активизируют ферменты, но и определяют физико-химические свойства сред (осмотическое давление, рН и др.). При культивировании ряда микроорганизмов в среды вносят факторы роста — витамины, некоторые аминокислоты, которые клетка не может синтезировать;

Микроорганизмы, как все живые существа, нуждаются в большом количестве воды.

2) иметь оптимальную концентрацию водородных ионов — рН, Чтобы во время роста микроорганизмов кислые или щелочные продукты их жизнедеятельности не изменили рН, среды должны обладать буферностью, т. е. содержать вещества, нейтрализующие продукты обмена;

3) быть изотоничными для микробной клетки, т. е. осмотическое давление в среде должно быть таким же, как внутри клетки. Для большинства микроорганизмов оптимальна среда, соответствующая 0,5% раствору натрия хлорида;

4) быть стерильными, так как посторонние микробы препятствуют росту изучаемого микроба, определению его свойств и изменяют свойства среды (состав, рН и др.);

5) плотные среды должны быть влажными и иметь оптимальную для микроорганизмов консистенцию;

6) обладать определенным окислительно-восстановительным потенциалом, т. е. соотношением веществ, отдающих и принимающих электроны. Этот потенциал показывает насыщение среды кислородом.

Желательно, чтобы среды были прозрачными — удобнее следить за ростом культур, легче заметить загрязнение среды посторонними микроорганизмами.

8. Питательные среды. Для приготовления используют сухую питательную среду или ингредиенты для приготовления питательной среды с неизмененным видом, консистенцией, в неповрежденной упаковке организации изготовителя или организации-поставщика.Химические вещества, используемые для приготовления питательных сред, разбавителей и растворов, используемых в микробиологических испытаниях, должны соответствовать степени чистоты не ниже ЧДА.Сухие питательные среды (ингредиенты для приготовления питательных сред) с истекшим сроком годности не используются.

Для приготовления питательной среды необходимо использовать чистую, неповрежденную стеклянную посуду и дистиллированную или деионизированную воду.

При приготовлении питательной среды из сухой питательной среды необходимо строго соблюдать инструкцию по приготовлению организации-изготовителя.

Для получения качественных, стабильных по составу питательных сред, необходимо соблюдать следующие дополнительные правила приготовления:

- навеску сухой питательной среды (составных ингредиентов) помещают в подготовленную посуду, объем которой в 2-3 раза превышает окончательный объем готовой среды;

- растворение сухой питательной среды (составных ингредиентов) осуществляют путем постепенного добавления небольших количеств воды при постоянном перемешивании;

- в случае необходимости для полного растворения используют нагревание, избегая при этом продолжительного и чрезмерного нагрева, а также подгорании питательной среды.

Приготовленные питательные среды разливают в стерильную посуду, которую закрывают пробками или другими приемлемыми способами, и стерилизуют согласно инструкции по приготовлению питательной среды.Введение термолабильных добавок в питательную среду, если они предусмотрены рецептурой, осуществляют сразу после стерилизации. Для этого жидкую питательную среду предварительно охлаждают до комнатной температуры, агаризованную питательную среду до +45(+50)⁰С и, соблюдая асептические условия, вносят необходимое количество добавки в емкость с питательной средой, после чего тщательно перемешивают для равномерного распределения добавки по всему объему питательной среды.Приготовленные в лаборатории питательные среды (питательная среда (ПС2) и питательная среда (ПС3)), а также питательная среда (ПС4) разливают в пробирки, флаконы или чашки Петри, соблюдая асептические условия.

Во избежание появления обильного конденсата на крышках чашки Петри стерильные агаровые среды перед розливом должны иметь температуру +45(+50)⁰С.

Допускается использование автоматических систем для приготовления и розлива питательных сред.

На каждую единицу приготовленной питательной среды (ПС2,ПС3) или разлитой в лаборатории питательной среды (ПС4) наносят маркировку, содержащую наименование, дату приготовления (розлива) и срок годности. Допускается нанесение только групповой маркировки при условии одномоментного использования ПС2,ПС3 или ПС4

Каждая приготовленная питательная среда должна контролироваться испытательной лабораторией:- внешний вид готовой питательной среды;- рН готовой питательной среды;- стерильность (отсутствие контаминации) готовой питательн;- биологические свойства готовой питательной среды.

9. Уровни организации, принципы и критерии систематики и классификации м/о. Молекулярный уровень. Элементарными единицами этого уровня организации жизни являются химические вещества: нуклеиновые кислоты, белки, углеводы, липиды и др. Основная стратегия жизни на молекулярном уровне — способность создавать живое вещество и кодировать информацию, приобретенную в меняющихся условиях среды. На клеточном уровне организации структурными элементами выступают различные органеллы. Стратегия жизни на клеточном уровне — вовлечение химических элементов Земли и энергии Солнца в живые системы. Организменный уровень организации присущ одноклеточным и многоклеточным биосистемам (растениям, грибам, животным, в том числе человеку и разнообразным микроорганизмам. Основная стратегия жизни на этом уровне — ориентация организма (особи) на выживание в постоянно меняющихся условиях среды. Популяционно-видовой уровень организации характеризуется объединением родственных особей в популяции, а популяций — в виды, что приводит к возникновению новых свойств системы. Основные свойства этого уровня: рождаемость, смертность, выживание, структура (половая, возрастная, экологическая), плотность, численность, функционирование в природе. На биогеоценотическом (экосистемном) уровне организации основными структурными элементами являются популяции разных видов. Основная стратегия этого уровня — активное использование всего многообразия окружающей среды и создание благоприятных условий развития и процветания жизни во всем ее многообразии. Самым высоким уровнем организации жизни является биосферный. Основная стратегия жизни на биосферном уровне — стремление обеспечить динамичную устойчивость биосферы как самой большой экосистемы нашей планеты.

Под систематикой понимают процесс описания и обозначения организмов, а также их распределение по таксонам (классификация).

Критерии систематики: Генетические критерии систематики. Наиболее объективными и дающими представление о филогенетических связях между микроорганизмами являются генетические (молекулярно-биологические) критерии. Фенотипические критерии систематики.В классификации бактерий используют набор фенотипических признаков: морфологических, культуральных, физиологических и биохимических. Серологические критерии систематики. Серологические (от лат. serum – сыворотка) критерии систематики основаны на специфических реакциях взаимодействия антигенов идентифицируемых микроорганизмов с антителами, содержащимися в сыворотках.

Классификация микроорганизмов.

Микроорганизмы - это организмы, невидимые невооруженным глазом из-за их незначительных размеров. Этот критерий - единственный, который их объединяет.

Согласно современной систематике, микроорганизмы относятся к трем царствам:

Vira - к ним относятся вирусы;

Eucariotae - к ним относятся простейшие и грибы;

Procariotae - к ним относятся истинные бактерии, риккетсии, хламидии, микоплазмы, спирохеты, актиномицеты.

Имеется также ряд признаков или органелл, характерных для многих, но не для всех прокариот, которые позволяют отличать их от эукариотов:

1.многочисленные инвагинации цитоплазматической мембраны, которые называются мезосомы, они связаны с нуклеоидом и участвуют в делении клетки, спорообразовании, и дыхании бактериальной клетки;

2.специфический компонент клеточной стенки - муреин, по химической структуре - это пептидогликан (диаминопиеминовая кислота);

3.плазмиды - автономно реплицирующиеся кольцевидные молекулы двунитевой ДНК с меньшей, чем хромосома бактерий молекулярной массой.

10.Прокариоты. Форма клеток бактерий, а также характер клеточных скоплений – это важный таксономический признак, который легко выявляется при микроскопировании. Для эубактерий характерны три принципиально различающиеся формы клеток: сферическая (кокковидная), цилиндрическая (палочковидная) и извитая. Сферические клетки (кокки). По форме напоминают шары, но могут выглядеть как эллипсоиды, быть слегка уплощенными или односторонневогнутыми. Особенностью сферических клеток является способность делиться в нескольких плоскостях. Цилиндрические клетки (палочки). Эти клетки по форме напоминают цилиндры (характеризуются одинаковым диаметром на протяжении всей длины). Палочковидные клетки делятся только в одной плоскости – перпендикулярно оси цилиндра. При этом они могут не формировать скоплений и располагаться поодиночке, либо образовывать скопления в виде пар клеток (диплобактерии) или цепочек (стрептобактерии). . Чаще всего палочки имеют закругленные окончания, реже – суженные или срезанные под определенным углом. Извитые клетки. Эти клетки могут иметь разное число «завитков» в своем составе, что закреплено генетически (видоспецифичный признак) и определяет название бактерий. Содержащие один завиток клетки называют вибрионами, включающие 3–5 завитков – спириллами, имеющие большее число завитков – спирохетами. . Кроме перечисленных форм, которые преобладают среди прокариот, встречаются клетки необычной формы, а отдельные виды, кроме того, формируют клетки, изменчивые по форме и размерам (плеоморфизм).К необычным формам можно отнести: клетки с выростами, с утолщениями, булавовидной формы, нитчатые (цепочки палочек, окруженные общим чехлом), веретенообразные, коккобактерии (переходная форма между кокками и палочками) и др.Архебактерии часто имеют экзотическую форму клеток: ланцетовидную, пластинкообразную, крючковидную, овальную, спиралевидную и др.

Подавляющее большинство прокариот размножается бинарным делением, в результате которого формируются две идентичные клетки. Важно отметить, что среди них нельзя выделить материнскую и дочернюю, эти клетки одинаковы по структуре, форме и размеру.

Процесс размножения обычно начинается, когда клетка достигнет максимальных размеров. Делению клетки предшествует репликация (удвоение ДНК). Механизм бинарного деления у грамположительных и грамотрицательных бактерий может несколько отличаться.

У грамположительных бактерий деление чаще начинается с образования инвагинаций (впячиваний) плазматической мембраны, которые вскоре встречаются, а затем между ними формируется пептидогликановый слой. Подобная структура называется перегородкой, она делит содержимое клетки на две части. В этом случае диаметр делящейся клетки не изменяется на протяжении всего процесса деления. У грамотрицательных бактерий бинарное деление может сопровождаться образованием перетяжки, которая формируется при сужении в центральной части клетки плазматической мембраны и клеточной стенки. При этом диаметр клетки в центре постепенно уменьшается, как будто кто-то перетягивает ее пополам. Отверстие между образующимися отсеками становится все уже, пока, наконец, не исчезнет совсем и перетяжка не разделит клетку на две части. Еще одним способом размножения, характерным для некоторых прокариот, в первую очередь для представителей группы почкующихся бактерий, а также многих цианобактерий, является почкование. Это неравное деление. Его результатом становится формирование материнской клетки (более крупной, стареющей, неподвижной) и дочерней (меньших размеров, молодой, растущей, часто подвижной). При почковании в определенном месте на поверхности клетки образуется небольшой бугорок (почка), в которую переходит копия нуклеоида. Почка постепенно увеличивается в размерах и, наконец, отделяется от материнской клетки. У некоторых бактерий почки формируются на выростах. Отдельные представители цианобактерий способны размножаться множественным делением, когда внутри клетки разграничивается цитоплазма и формируется несколько (иногда до 1000) мелких сферических клеток, которые высвобождаются при разрыве клеточной стенки.

Классификация. Грамотрицательные эубактерии: относятся эубактерии, клеточные стенки которых содержат один слой муреина, наружную мембрану (раздел 1.3, рис. 10) и окрашиваются по Граму отрицательно. Здесь представлены все типичные формы прокариотических клеток. Размножение происходит путем бинарного деления, реже – почкования или множественного деления. Для представителей характерны все возможные способы запасания энергии: дыхание, брожение, фотосинтез. Есть неподвижные и подвижные формы (16 групп).Грамположительные (13 групп): прокариоты с клеточными стенками грамположительного типа. Клетки могут иметь сферическую, палочковидную форму или образовывать нити. Есть ветвящиеся формы. Размножение у большинства представителей осуществляется бинарным делением, у актиномицетов – бесполыми спорами и фрагментацией мицелия. Некоторые виды образуют покоящиеся формы – эндоспоры или споры на гифах. Запасают энергию в ходе дыхания или брожения, один вид осуществляет фотосинтез.Эубактерии лишенные клеточной стенки: ,содержит 1 группу – микоплазмы, или молликуты.У них отсутствие клеточной стенки – пограничным слоем клеток служит эластичная плазматическая мембрана. Поэтому для микоплазм характерен сильно выраженный плеоморфизм. Их клетки очень мелкие, чаще неподвижные, содержат необычно маленький геном.Архебактерии(5 групп) обособленная группа прокариот.

11. ЭУКАРИОТЫ (грибы и дрожжи)

Эукарио́ты, или Я́дерные (лат. Eukaryota от греч. εύ- — хорошо иκάρυον — ядро) — домен (надцарство) живых организмов, клеткикоторых содержат ядра. Все организмы, кроме бактерий и архей, являются ядерными (вирусы и вироиды также не являются эукариотами, но не все биологи считают их живыми организмами).

Животные, растения, грибы, а также группы организмов под общим названием протисты — все являются эукариотическими организмами. Они могут быть одноклеточными и многоклеточными, но все имеют общий план строения клеток. Считается, что все эти столь несхожие организмы имеют общее происхождение, поэтому группа ядерных рассматривается как монофилетический таксоннаивысшего ранга. Согласно наиболее распространённым гипотезам, эукариоты появились 1,5–2 млрд. лет назад. Важную роль в эволюции эукариот сыграл симбиогенез — симбиоз между эукариотической клеткой, видимо, уже имевшей ядро и способной к фагоцитозу, и поглощенными этой клеткой бактериями — предшественниками  митохондрий  и  пластидов.

Эукариотические клетки в среднем намного крупнее прокариотических, разница в объёме достигает тысяч раз. Клетки эукариот включают около десятка видов различных структур, известных как органоиды (или органеллы, что, правда, несколько искажает первоначальное значение этого термина), из которых многие отделены от цитоплазмы одной или несколькими мембранами (в прокариотических клетках внутренние органоиды, окруженные мембраной, встречаются редко). Ядро — это часть клетки, окружённая у эукариот двойной мембраной (двумя элементарными мембранами) и содержащая генетический материал: молекулы ДНК, «упакованные» в хромосомы. Ядро обычно одно, но бывают и многоядерные клетки.

Деление на царства.Существует несколько вариантов деления надцарства эукариот на царства. Первыми были выделены царства растений иживотных. Затем было выделено царство грибов, которые из-за биохимических особенностей, по мнению большинства биологов, не могут быть причислены ни к одному из этих царств. Также некоторые авторы выделяют царства простейших, миксомицетов,хромистов. Некоторые системы насчитывают до 20 царств. По системе Томаса Кавалир-Смита все эукариоты подразделяются на два монофилетических таксона (поддомена) — Unikonta и Bikonta. Положение таких эукариот, как коллодиктион (Collodictyon) и Diphylleia, на данный момент не определено.

Отличия эукариот от прокариот. Важнейшая, основополагающая особенность эукариотических клеток связана с расположением генетического аппарата в клетке. Генетический аппарат всех эукариот находится в ядре и защищён ядерной оболочкой (по-гречески «эукариот» значит имеющий ядро). ДНК эукариот линейная (у прокариот ДНК кольцевая и находится в особой области клетки — нуклеоиде, который не отделён мембраной от остальной цитоплазмы). Она связана с белками-гистонами и другими белками хромосом, которых нет у бактерий.

В жизненном цикле эукариот обычно присутствуют две ядерные фазы (гаплофаза и диплофаза). Первая фаза характеризуется гаплоидным (одинарным) набором хромосом, далее, сливаясь, две гаплоидные клетки (или два ядра) образуют диплоидную клетку (ядро), содержащую двойной (диплоидный) набор хромосом. Иногда при следующем делении, а чаще спустя несколько делений клетка вновь становится гаплоидной. Такой жизненный цикл и в целом диплоидность для прокариот не характерны.

Третье, пожалуй, самое интересное отличие, — это наличие у эукариотических клеток особых органелл, имеющих свой генетический аппарат, размножающихся делением и окружённых мембраной. Эти органеллы — митохондрии и пластиды. По своему строению и жизнедеятельности они поразительно похожи на бактерий. Это обстоятельство натолкнуло современных учёных на мысль, что подобные организмы являются потомками бактерий, вступившими в симбиотические отношения с эукариотами. Прокариоты характеризуются малым количеством органелл, и ни одна из них не окружена двойной мембраной. В клетках прокариот нет эндоплазматического ретикулума, аппарата Гольджи, лизосом.

Ещё одно важное различие между прокариотами и эукариотами — наличие у эукариот эндоцитоза, в том числе у многих групп — фагоцитоза. Фагоцитозом (дословно «поедание клеткой») называют способность эукариотических клеток захватывать, заключая в мембранный пузырёк, и переваривать самые разные твёрдые частицы. Этот процесс обеспечивает в организме важную защитную функцию. Размеры прокариотических клеток несоизмеримо меньше, и поэтому в процессе эволюционного развития эукариот у них возникла проблема снабжения организма большим количеством пищи. Как следствие среди эукариот появляются первые настоящие, подвижные хищники.

Большинство бактерий имеет клеточную стенку, отличную от эукариотической (далеко не все эукариоты имеют её). У прокариот это прочная структура, состоящая главным образом из муреина (у архей из псевдомуреина). Строение муреина таково, что каждая клетка окружена особым сетчатым мешком, являющимся одной огромной молекулой. Среди эукариот клеточную стенку имеют многие протисты, грибы и растения. У грибов она состоит из хитина и глюканов, у низших растений — из целлюлозы игликопротеинов, диатомовые водоросли синтезируют клеточную стенку из кремниевых кислот, у высших растений она состоит из целлюлозы, гемицеллюлозы и пектина. Видимо, для более крупных эукариотических клеток стало невозможно создавать клеточную стенку из одной молекулы высокую по прочности. Это обстоятельство могло заставить эукариот использовать иной материал для клеточной стенки. Другое объяснение состоит в том, что общий предок эукариот в связи с переходом к хищничеству утратил клеточную стенку, а затем были утрачены и гены, отвечающие за синтез муреина. При возврате части эукариот к осмотрофному питанию клеточная стенка появилась вновь, но уже на другой биохимической основе.

Разнообразен и обмен веществ у бактерий. Вообще всего выделяют четыре типа питания, и среди бактерий встречаются все. Это фотоавтотрофные, фотогетеротрофные, хемоавтотрофные, хемогетеротрофные (фототрофные используют энергию солнечного света, хемотрофные используют химическую энергию). Эукариоты же либо сами синтезируют энергию из солнечного света, либо используют готовую энергию такого происхождения. Это может быть связано с появлением среди эукариотов хищников, необходимость синтезировать энергию для которых отпала.

Ещё одно отличие — строение жгутиков. У бактерий жгутиками являются полые нити диаметром 15–20 нм из белка флагеллина. Строение жгутиков эукариот гораздо сложнее. Они представляют собой вырост клетки, окруженный мембраной, и содержат цитоскелет (аксонему) из девяти пар периферических микротрубочек и двух микротрубочек в центре. В отличие от вращающихся прокариотическох жгутиков жгутики эукариот изгибаются или извиваются.

Две группы рассматриваемых нами организмов, как уже было сказано, сильно отличаются и по своим средним размерам. Диаметр прокариотической клетки составляет обычно 0,5–10 мкм, когда тот же показатель у эукариот составляет 10–100 мкм. Объём такой клетки в 1000–10000 раз больше, чем прокариотической.

Рибосомы прокариот мелкие (70S-типа). Клетки эукариот содержат как более крупные рибосомы 80S-типа, находящиеся в цитоплазме, так и 70s-рибосомы прокариотного типа, расположенные в митохондриях и пластидах.

Видимо, различается и время возникновения этих групп. Первые прокариоты возникли в процессе эволюции около 3,5 млрд. лет назад, от них около 1,2 млрд. лет назад произошли эукариотические организмы

12. Взаимосвязь между микроорганизмами и средой. Классификация факторов воздействия на микроорганизмы

Жизнедеятельность микроорганизмов тесно связана с окружающей средой.

С одной стороны, деятельность микроорганизмов значительно изменяет окружающую среду в результате удаления из нее питательных веществ и выделения продуктов обмена. С другой стороны, интенсивность обменных процессов зависит от условий окружающей среды.

Наука о взаимоотношениях живых организмов с окружающей средой называется экологией, а отдельные свойства среды обитания, воздействующие на организмы, называют экологическими факторами. Некоторые из этих факторов необходимы клетке, а некоторые, наоборот, вредны, так как могут вызывать приостановление роста и развития микроорганизмов, а при интенсивном воздействии неблагоприятных факторов может наступить гибель микроорганизмов.

Гибель микроорганизмов – необратимая утрата способности к росту и размножению. Воздействие фактора внешней среды, вызывающее гибель микроорганизма, называют бактерицидным действием. Восстановление способности к росту и размножению после воздействия неблагоприятного фактора носит название реактивация. Действие неблагоприятного фактора в этом случае называется бактериостатическим.

Под действием экологических факторов возможен также мутагенез – изменение наследственных свойств клетки.

Воздействие каждого фактора внешней среды определяется степенью воздействия или его интенсивностью.

Кроме того, при оценке воздействия некоторых внешних факторов различают три кардинальные точки: минимум, оптимум и максимум. Развитие микроорганизмов возможно между минимальной и максимальной границами. При оптимальных условиях жизнедеятельность микроорганизма проявляется наиболее интенсивно.

Закон минимума: если хотя бы один фактор воздействия будет находиться ниже минимума или выше максимума, микроорганизм не сможет развиваться даже при оптимальных значениях всех остальных факторов.

В технической микробиологии закон минимума применим в двух случаях: когда нужно создать наилучшие условия для развития микроорганизмов и тем самым интенсифицировать технологический процесс и когда необходимо подавить развитие посторонней микрофлоры или полностью уничтожить микроорганизмы.

Экологические факторы весьма многообразны и изменчивы, поэтому микроорганизмы постоянно приспосабливаются к ним и регулируют свою жизнедеятельность в соответствии с их изменениями.

Внешние факторы можно также разделить в зависимости от их природы на: физические – воздействие температуры, лучистой энергии, электромагнитных колебаний; физико-химические – влияние влажности, осмотического давления; химические – влияние рН, окислительно-восста­новительных условий среды, химических факторов; биологические – взаимоотношения между микроорганизмами, влияние антибиотиков и фитонцидов.

Влияние физических факторов на микроорганизмы

Температура – один из основных факторов, определяющих возможность и интенсивность размножения микроорганизмов.

Действие высоких температур на микроорганизмы. Повышение температуры выше максимальной может привести к гибели клеток. Гибель микроорганизмов наступает не мгновенно, а во времени. При незначительном повышении температуры выше максимальной микроорганизмы могут испытывать «тепловой шок» и после недлительного пребывания в таком состоянии они могут реактивироваться.

Влияние низких температур на микроорганизмы. К низким температурам микроорганизмы более устойчивы, чем к высоким. Несмотря на то, что размножение и биохимическая активность микроорганизмов при температуре ниже минимальной прекращаются, гибели клеток не происходит, т.к. микроорганизмы переходят в состояние анабиоза (скрытой жизни) и остаются жизнеспособными длительное время. При повышении температуры клетки начинают интенсивно размножаться.

Лучистая энергия. В природе микроорганизмы постоянно подвергаются воздействию солнечной радиации. Свет необходим для жизнедеятельности фототрофов. Хемотрофы могут расти и в темноте, а при длительном воздействии солнечной радиации эти микроорганизмы могут погибнуть.

Электромагнитные колебания и ультразвук. Радиоволны  это электромагнитные волны, характеризующиеся относительно большой длиной (от миллиметров до километров) и частотами от 3·10⁴ до 3·10¹¹ герц.

Гибель микроорганизмов в электромагнитном поле высокой интенсивности наступает в результате теплового эффекта, но полностью механизм действия СВЧ-энергии на микроорганизмы не раскрыт.

Влияние физико-химических факторов на микроорганизмы

Влажность. Влажность среды оказывает большое воздействие на жизнедеятельность микроорганизмов. Вода входит в состав клеток и поддерживает тургорное давление в них. Кроме того, питательные вещества проникают внутрь клетки лишь в растворенном состоянии. Обезвоживание субстрата приводит к задержке развития микроорганизмов (состояние анабиоза). При повышении влажности жизнедеятельность микроорганизмов восстанавливается.

Осмотическое давление (концентрация растворенных веществ в среде). Осмотическое давление внутри клеток микроорганизмов несколько выше, чем в среде. Это является условием нормальной жизнедеятельности микроорганизмов.