- •2. Характеристика процесса репликации
- •3. Гипотетические механизмы репликации.
- •4. Ферменты и белки, принимающие участие в репликации
- •Головні білки реплікації
- •5. Стадии репликации: инициация, элонгация, терминация (на примере e.Coli).
- •6.Отличия репликации у эукариот и прокариот
- •Типы репликации
- •8. Проблема репликации линейных концов днк. Теломераза.
- •Тема 2. Геномы организмов
- •Геном прокариот
- •Уcтройство генов прокариотов
- •Обозначения к схеме и пояснения
- •Тема 3: геномы эукариот
- •Тема 4: Репарация
- •Классификация систем репарации
- •Типы рестриктаз
- •Іі. Репликационная система репарации
- •1. Репарация по ходу репликации
- •2. Репликационная репарация после метилирования дочерней цепи
- •3. Прямая репарация
- •4. Эксцизионная репарация
- •Индуцированная sos-репарация
- •Sos-оперон у e.Coli
- •III. Пострепликативная репарация (рекомбинационная)
- •Тема 5: мобильные генетические элементы (мгэ)
- •Плазмиды
- •Свойства плазмид
- •Характеристика некоторых видов плазмид
- •Транспозоны
- •Мобильные генетические элементы прокариот
- •Is-элементы
- •Is-подобные транспозоны
- •Is-модули
- •Мобильные генетические элементы эукариот
- •Тема 6: регуляция метаболизма
- •Регуляция на уровне транскрипции
- •Регуляция экспрессии генов на уровне трансляции
- •Тема 7. Конструирование рекомбинантных днк (основы генной инженерии)
- •I этап. Получение генов или фрагментов днк для последующего встраивания в хромосому реципиента
- •Синтез гена химическим путем
- •Использование обратной транскриптазы
- •Метод дробовика (дробового ружья)
- •Іі этап. Конструирование рекомбинантных молекул с помощью векторов. Векторы и принципы их конструирования
- •III этап. Введение рекомбинантного вектора в клетку реципиента
- •IV этап. Клонирование рек-днк и идентификация рекомбинантных клеток
I этап. Получение генов или фрагментов днк для последующего встраивания в хромосому реципиента
Самый важной и трудоемкой задачей при создании рекомбинантов является получение нужных генов или фрагментов ДНК для введения в клетки реципиентов. Имеется несколько методических приемов для осуществления этой задачи: синтез генов химическим путем, использование обратной транскриптазы, метод дробовика (дробового ружья).
Синтез гена химическим путем
Впервые был синтезирован ген аланиновой т-РНКдрожжей Кораной в 1969 г. после того, как была расшифрована последовательность нуклеотидов в нем (всего 77 пар нуклеотидов).Сначаласинтезировали небольшие фрагменты по 4-13 п.н.,а затем сшивали их лигазой. Однако этот ген оказался неактивным,так как не содержал регуляторных элементов.
В 1976 году Корана с сотрудниками добился успеха, синтезировав ген тирозиновой т-РНК кишечной палочки, который уже содержал промотор из 52 п.н., структурную часть из 126 п.н. и терминатор из 121 п.н.. После встраивания в геном мутантного фага Т4 ген заработал как естественный.
Для химического синтеза гена сначала должна быть установлена его первичная структура путем секвенирования (определения последовательности нуклеотидов) ДНК или м-РНК, или с помощью анализа аминокислотного состава кодируемого геном белка. Для установления нуклеотидных последовательностей сейчас существует два подхода – метод Максама и Гилберта, основаный на химической модификации оснований и метод Сенгера на принципе полимеразного копирования с использованием аналогов нуклеотидов для терминации роста цепи. Вхорошо оснащенных генно-инженерных лабораториях имеются специальные приборы – секвенаторы, автоматически определяющие последовательности нуклеотидов в ДНК или РНК.
Использование обратной транскриптазы
Задача синтеза гена значительно упростилась с открытием фермента обратной транскриптазы, обнаруженной впервые у РНК-содержащих ретровирусов. Ретровирусы используют обратную транскриптазу для синтеза ДНК-овой копии собственной РНК. Образующаяся при этом двухцепочечная молекула ДНК может легко интегрироваться в геном клетки-хазяина. В 1970 г. Темин и Митузани и независимо от них Балтимор выделили данный фермент из препарата внеклеточных вирионов вируса саркомы Рауса. По механизму действия этот энзим является РНК-зависимой ДНК-полимеразой, но чаще используются его тривиальные названия – обратная транскриптаза или ревертаза.
Обратная транскриптаза обладает по крайней мере тремя ферментативными активностями:
ДНК-полимеразной, использующей в качестве матрицы как РНК, так и ДНК;
Активностью РНК-азы Н, гидролизующей цепь РНК в составе гибрида РНК-ДНК, но не одно- или двухцепочечную РНК;
ДНК-эндонуклеазной активностью.
Первые две активности необходимы для синтеза вирусной ДНК, а эндонуклеаза очевидно участвует в интеграции вирусной ДНК в геном клетки-хозяина.
В генной инженерии обратную транскриптазу используют для получения ДНК-овой копии гена, если удается выделить из донорной клетки соответствующую гену m-РНК (матричную, информационную РНК).
Синтез гена с помощью ревертазы ведут таким образом: сначала в систему вводят m-РНК, набор ДНК-овых нуклеотидов, небольшие затравки для синтеза – праймеры – олиго (dT) и обратную транскриптазу, которая начинает синтезировать на матрицеm-РНК комплементарную цепь ДНК; затем с помощью щелочного гидролиза удаляютm-РНК, а обратная транскриптаза «делает разворот», и используя только что образованную цепь ДНК как матрицу, синтезирует на ней еще одну комплементарную цепь. Для ускорения синтеза второй цепи ДНК на этой стадии иногда добавляют ДНК-полимеразуIE.coli, которая дублирует полимеризующую активность ревертазы. По окончании синтеза первая и вторая цепи ДНК оказываются связанными петлей в виде шпилечной структуры. Эту петлю расщепляют эндонуклеазойS1, которая способна специфически гидролизовать одноцепочечные участки нуклеиновых кислот. В результате получают полноценную ДНК-овую копию гена, которую можно легко встроить в вектор и ввести в клетку-реципиента.
Однако при использовании ревертазы есть свои сложности. Так, m-РНК не содержит регуляторных участков (промоторов и терминаторов), что вызывает необходимость достраивать их в векторе. Кроме того, выделитьm-РНК в чистом виде достаточно сложно.