8.11. Диагностические системы для определения сывороточного железа

• Доминирующий метод определения железа сыворотки крови - спектрометрия. Колориметрическое определение железа сыворотки крови предполагает проведение нескольких этапов: диссоциацию железа из комплекса с трансферрином, восстановление иона железа из Fe³+ в Fe²+, формирование комплекса железо-хелатированный хромоген.

• Часть белков в кислой среде мешает определению окрашенного комплекса, что требует депротеинизации. Международным комитетом по стандартизации в гематологии предложено преципитировать белки трихлоруксусной кислотой. Однако вследствие широкого применения автоматизированных систем методы, включающие депротеинизацию, большого распространения не получили. В прямых методах стабилизация белков достигается добавлением детергентов.

• Диссоциацию комплекса железо-трансферрин осуществляют снижением рН. Для диссоциации комплекса предпочтительно значение рН 5,0, при этом одновременное добавление восстановителя позволяет провести диссоциацию полностью. В качестве восстановителей наиболее распространено применение аскорбиновой кислоты.

8.12. Лабораторная диагностика аномалий обмена отдельных аминокислот

Фенилкетонурия

• Наследственная болезнь, обусловленная нарушением обмена фенилаланина; проявляется отставанием в физическом развитии и прогрессирующим слабоумием, расстройствами движений и мышечного тонуса. 

• Фенилаланин является незаменимой аминокислотой для построения белковой молекулы и, кроме того, служит предшественником гормонов щитовидной железы (в частности, тироксина), адреналина и меланина. Метаболический блок при отсутствии фенилаланин-4-гидроксилазы приводит к накоплению поступающего с пищей фенилаланина во всех жидких средах организма.

• Последствиями энзиматического дефекта являются также активация вспомогательных путей распада фенилаланина и накопление в тканях токсических продуктов его обмена, вторичные нарушения обмена тирозина и триптофана: пониженное образование нейромедиаторов головного мозга, обусловливающее запуск патогенетического механизма задержки умственного развития и прогрессирующего слабоумия.

Диагностика

•  Диагнозосновывается на обнаружении в сыворотке крови новорожденного повышенной концентрации фенилаланина с помощью микробиологического теста Гатри и его аналогов.

• Для выявления в моче фенилпировиноградной кислоты и других кетоновых кислот, появляющихся к концу 1-й недели жизни, используют пробу Феллинга с 5—10% раствором FeCI₃или применяют индикаторные бумажки «Фенистикс», «Биофан» и др. Проба считается положительной при появлении сине-зеленого окрашивания.

• С помощью автоматического аминоанализатора осуществляют количественное определение концентрации фенилаланина в крови.

• Нагрузочные пробы с L-фенилаланином используют для уточнения причин гиперфенилаланинемии и для определения гетерозиготного носительства.

Цистиноз

• Наследственное заболевание, обусловленное первичным нарушением обмена цистина с отложением его кристаллов в органах и тканях, в том числе почках, приводящее к развитию тяжелойнефропатии с вторичным тубулоинтерстициальным синдромом и картиной Б-резистентного рахита.

Диагностика

• Для верификации цистиноза считается достаточным выявление офтальмологом при осмотре кристаллов в роговице у пациента с синдромом Фанкони, так как подобные кристаллы не обнаруживаются при других причинах.

• Гексагональные или прямоугольные кристаллы цистина можно обнаружить в роговице (при исследовании с помощью щелевой лампы), в лейкоцитах периферической крови или костного мозга или в биоптатах слизистой оболочки прямой кишки. Диагноз подтверждают путем количественного определения цистина в лейкоцитах периферической крови или в культуре фибробластов. 

• Ранний диагноз может быть установлен и с помощью генетического исследования – при наличии анамнеза рекомендуется пренатальная диагностика болезни с помощью измерения уровня свободного цистина в культуре амниоцитов или клетках ворсин хориона, или с помощью генетического исследования.

Цистинурия

• Аминоацидурия (аминокислотурия)- увеличение экскреции аминокислот с мочой или присутствие в моче продуктов аминокислот, которые в норме не содержатся в ней (например, кетоновые тела).

• Цистинурия (cystinuria; цистин + греч. uron моча) — наследственное заболевание, обусловленное нарушением транспорта двухосновных аминокислот (цистина, лизина, аргинина, орнитина) в эпителиальных клетках почечных канальцев и желудочно-кишечного тракта; тип наследования аутосомно-рецессивный.

• Уролитиаз.

Диагностика

• Микроскопическое исследование мочевого осадка с целью обнаружения кристаллов цистина. Самым надежным скринирующим тестом на избыточное содержание цистина в моче является реакция с цианид-нитропруссидом: при концентрации цистина выше 75 мг/л смесь приобретает цвет красного вина. Проводить тест следует с порцией из суточной мочи.

• Для уточнения диагноза и дифференциальный диагностики с ацетонурией, при которой также отмечают положительную реакцию с цианиднитропруссидом, необходимо проведение дополнительного исследования мочи методами тонкослойной хроматографии, высоковольтного электрофореза или с помощью хроматографии на ионообменных смолах для определения профиля экскретируемых аминокислот. 

Алкаптонурия

• Наследственное заболевание, обусловленное выпадением функций оксидазы гомогентизиновой кислоты и характеризующееся расстройством обмена тирозина и экскрецией с мочой большого количества гомогентизиновой кислоты. 

• В нормальных условиях гомогентизиновая кислота — промежуточный продукт распада тирозина и фенилаланина — переводится в малеилацетоуксусную кислоту, из которой в конечном счёте образуютсяфумаровая и ацетоуксусная кислоты, вступающие в другие биохимические циклы. 

Диагностика

• Наиболее информативным для диагностики алкаптонурии является метод количественного определения гомогентизиновой кислоты и бензохиноуксусной кислоты в моче. Для этого используетсяферментативная спектрофотометрия или жидкостная хроматография.

• Более простым, но менее точным способом выявления данного заболевания является оценка цвета мочи через 12-24 ч после пребывания ее на воздухе. В этом случае происходит окисление алкаптона, что приводит к изменению цвета мочи (становится бурой или черной). Данные изменения происходят только при щелочных значениях рН мочи, поэтому при кислой реакции мочи необходимо ее подщелачивание.

• Важно разграничить генетическую алкаптонурию от алкаптонурии при гиповитаминозе С. Последняя исчезает после назначения адекватной дозы аскорбиновой кислоты.

Гомоцистинурия

• Наследственная болезнь, обусловленная нарушением обмена метионина, характеризующаяся поражением соединительной ткани, нервной, костной, мышечной и сердечно-сосудистой систем.

• В результате снижения активности специального фермента печени (цистатионинсинтетазы) в организме ребенка накапливаются метионин и гомоцистин, оказывающие повреждающее действие на ряд систем организма (костную и центральную нервную системы).

Диагностика

• Пациенты с подозрением на гомоцистинурию должны направляться к медицинскому генетику для анализа генеалогических данных и проведения молекулярно-генетической диагностики. Диагноз устанавливается с помощью биохимического исследования крови и мочи: при гомоцистинурии в моче, плазме крови, ликворе обнаруживаются значительные количества гомоцистина, повышение содержания метионина при сниженном уровне цистина. В биоптатах кожи и печени выявляется специфический ферментативный дефект.

Болезнь Хартнупа

• Хартнупа болезнь [по имени больного Хартнупа (Е. Hartnup)] — наследственная аномалия обмена триптофана, проявляющаяся поражением кожи и нервной системы.

Диагностика

• В моче больных отмечается полное отсутствие триптофана, обнаруживаются значительные количества глутамина, аспарагина, гистидина, серина, треонина. Экскреция пролина, метионина, аргинина снижена.

• Гипераминоацидурия объясняется повреждением почечных канальцев индольными продуктами, поступающими из кишечника.

• Выведение индикана с мочой в несколько раз превышает норму.

• В моче обнаруживают значительное количество индолилмолочной и индолилуксусной кислот.

Введение антибиотиков широкого спектра действия приводит к полному прекращению экскреции индольных продуктов с мочой, что может быть использовано как диагностический тест.