Темнопольна мікроскопія

T.pallidum

Завдання 2. Здійснити бактеріоскопічну діагностику поворотного тифу, дослідити морфологію мікробів у мікроскопі.

Матеріал для дослідження

препарат з “товстої” краплі крові

Борелія поворотного тифу в крові,

забарвлення за методом

Романовського- Гімзи

Кров хворого

Завдання 3. Здійснити облік результатів реакції Васермана з метою серологічної діагностики сифілісу ( за схемою).

Для виконання реакції отримують сироватку крові, інактивують на водяному нагрівачі при 56⁰С 30 хв і розливають у 4 пробірки.

Використовується в реакції Васермана: 1) специфічний антиген, який містить антигени збудника – зруйновані ультразвуком трепонеми; 2) неспецифічний антиген – ліпоїдний екстракт із м’язів серця бика з лецетином і холестерином – кардіоліпідний антиген;

3) неспецифічний антиген – спиртовий екстракт ліпоїдів із м’язів серця бика з холестерином.

Таблиця 2. Схема виконання основного досліду реакції Васермана

Інгредієнти	Пробірка №1	Пробірка №2	Пробірка №3	Пробірка №4
Сироватка крові хворого, інактивована і розведена 1:5	0,5см3	0,5 см3	0,5 см3	0,5 см3
Антиген №1(специфічний)	0,5 см3	-	-	-
Антиген №2(неспецифічний)	-	0,5 см3	-	-
Антиген №3(неспецифічний)	-	-	0,5 см3	-
Комплемент (робоча доза)	0,5 см3	0,5 см3	0,5 см3	0,5 см3
Ізотонічний розчин NaCl (натрія хлориду)	-	-	-	0,5 см3

Термостат при температурі 37⁰ С упродовж 45 хв.

Гемолітична система сенсибілізована

1,0 см3

1,0 см3

1,0 см3

1,0 см3

Термостат при температурі 37⁰ С упродовж 1 год.

Результат:	Пробірка №1	Пробірка №2	Пробірка №3	Пробірка №4
з сироваткою хворого сифілісом	-Г	-Г	-Г	+Г
з нормальною сироваткою	+Г	+Г	+Г	+Г

Примітка: -Г гемолізу немає ; + Г гемоліз; + додатний результат; - від’ємний результат. Облік результатів проводиться після настання гемолізу у всіх контролях.

У 50% хворих реакція Васермана є додатною після появи твердого шанкру. В другому і третьому періодах сифілісу 75-90% додатних реакцій. Після лікування реакція Васермана від’ємна.

3. План і організаційна структура навчального заняття.

№ з/п	Етапи заняття	Розподіл часу	Види контролю	Засоби навчання
1	2	3	4	5
1.	Підготовчий етап	45 хв.
1.1.	Організаційні питання.	10 хв.
1.2.	Ознайомлення з темою практичного заняття та формування мотивації	10 хв.		Історичні довідки на стендах кафедри
1.3.	Контроль і оцінка початкового рівня підготовки.	25 хв.	Тестові завдання, усне опитування за стандартизованим переліком питань	Рекомендована навчально-методична література
2.	Основний етап.	60 хв.		Методична література та методичні рекомендації кафедри.
2.1.	Проведення досліджень і запис протоколу.		Перевірка протоколу
	Малюнок мікроскопічного препарату, виготовленого з крові хворого на поворотний тиф і висновок про результати мікроскопії. Малюнок мікроскопічного препарату, виготовленого з матеріалу хворого на сифіліс (з твердого шанкру), і висновок про виявленого мікроба. Схеми мікробіологічної діагностики сифілісу, поворотного тифу та лептоспірозів. Схему постановки основного досліду реакції Васермана. Таблицю диференціації епідемічного і ендемічного поворотного тифу. Препарати, які використовуються для діагностики, лікування і специфічної профілактики сифілісу, поворотного тифу та лептоспірозів. .	20 хв.		Таблиці, переліки, схеми, малюнки.
	Здійснення бактеріоскопічної діагностики сифілісу, поворотного тифу, дослідження морфології мікробів у мікроскопі. Облік результатів реакції Васермана, з метою серологічної діагностики сифілісу ( за схемою).	30 хв.		Мікробіологічні атрибути, готові препарати для мікроскопії і реакція Васермана для обліку
2.2.	Аналіз результатів досліджень та їх оцінка.	10 хв.	Усне опитування
3.	Заключний етап.	35 хв.
3.1.	Контроль кінцевого рівня підготовки та його оцінювання.	25 хв.	Тестові завдання, , перевірка та підписування протоколів.
3.2.	Загальна оцінка навчальної діяльності студента.	5 хв.
3.3.	Інформування студентів про тему та план наступного заняття.	5 хв.

3. Методика організації навчального процесу на практичному занятті.

1. Підготовчий етап.

Викладач має звернути увагу на організаційні питання: 1) відмітити відсутніх студентів у журналі; 2) звернути увагу на тему і план практичного заняття, необхідність підготовки до практичного заняття, відвідування лекції з цієї теми, поточного та підсумкового контролю рівня підготовки.

Сформулювати тему практичного заняття та її значення для подальшого вивчення мікробіології, вірусології та імунології і професійної діяльності лікаря, щоб сформувати мотивацію для цілеспрямованої навчальної діяльності

Коротко ознайомити студентів з історією відкриття, класифікацією спірохет, лептоспір, їх походженням, підкреслити пріоритет вітчизняних вчених в пізнанні патогенезу поворотного тифу. Заразність крові хворого була доведена в 1874 році Г.М. Мінхом в Одесі, в дослідах самозараження. Він вперше висловив думку, що переносником європейського поворотного і висипного тифу є кровосисні комахи. У 1881 році І.І. Мечніков дослідами на собі довів, що кров хворих людей є заразна. Роль вошей у передачі спірохети Обермейєра доведена дослідженнями Мейкі (1907), Сержана і Фолі (1908).

Патогенні спірохети належать до родини Spirochetaceae , порядку Spirochaetales. Родина складається з 5 родів. Збудники людини належать до 3 родів:Treponema( збудник сифілісу –T.pallidum, збудник фрамбезії –T.pallidumsubsp.tenue, збудник пінти -T.carateum);Borrelia (збудникепідемічного поворотного тифу –B.recurrentis, збудники кліщового поворотного тифу –B.persica,B.hispanicaта ін.) і родуLeptospiraродиниLeptospiraceae(збудник лептоспірозу - Leptospirainterrogans). Захворювання, які викликають спірохети, називаються спірохетозами. Вони мають певні спільні ознаки в патогенезі, клініці та епідеміології захворювань. Так, для спірохетозів характерний циклічний перебіг захворювань, особливо при поворотному тифі з повторними нападами лихоманки. Сифіліс також проходить у вигляді послідовних стадій. Наявність рецидивів спостерігається і при лептоспірозі. При всіх спірохетозах збудник виявляється в крові і тканинах. Поворотний тиф є типовою кров’яною інфекцією, передача якої можлива лише через кровососів (воші, кліщі). При сифілісі спірохети розмножуються в основному в тканинах, а на деяких стадіях перебувають у крові. При лептоспірозі спірохети також виявляють у крові і тканинах. Протягом практичної роботи лікар може зустрітися з різними спірохетозами.За даними Всесвітньої ОрганізаціїОхорониЗдоров’я кожного року в світі захворюєна сифіліс до50 млн.людей, в Європі - 40 тисяч, а число незареєстрованих випадків значно більше. Сифіліс є маркером СНІДу, який спричиняєвірусімунодефіциту людини. Останнім часом набув поширення бореліоз – хвороба Лайма – збудникB.burgdorferi, зареєстровані спорадичні випадки поворотного тифу, широко розповсюджений лептоспіроз в Україні. Тому доцільним і необхідним є проведення практичного заняття, яке присвячене розгляду і засвоєнню студентами патогенезу, принципів лабораторної мікробіологічної діагностики спірохетозів ( поворотного тифу, лептоспірозів і сифілісу). Все вище наведене зумовлює актуальність теми заняття та спрямоване на формування позитивної мотивації її вивчення.

Ознайомити студентів з навчальними цілями та планом заняття. Провести контроль початкового рівня підготовки з використанням тестів, ситуаційних задач (орієнтовний перелік тестів – додаток 2), усно опитати студентів за стандартизованим переліком питань, проаналізувати найбільш важливі теоретичні та практичні питання. З урахуванням рівня підготовки далі треба перейти до наступного етапу.

2. . Основний етап.

Цей етап передбачає проведення студентами запланованих досліджень, визначення результатів, їх оцінка, запис протоколу досліджень за встановленою формою. Рекомендується така послідовність проведення досліджень:

1. Студенти записують назву практичного заняття, план, мету та замальовують схему його виконання.

2. Студенти записують у протокол заняття схеми мікробіологічної діагностики сифілісу, поворотного тифу та лептоспірозів, постановки основного досліду реакції Васермана, таблицю диференціації епідемічного і ендемічного поворотного тифу, препарати, які використовуються для діагностики, лікування і специфічної профілактики сифілісу, поворотного тифу та лептоспірозів.

3. Викладач пояснює правила мікроскопії препарату з використанням імерсійних об’єктивів, а також демонструє: малюнок мікроскопічного препарату, виготовленого з крові хворого на поворотний тиф і робить висновок про результати мікроскопії; малюнок мікроскопічного препарату, виготовленого з матеріалу хворого на сифіліс (з твердого шанкру), і робить висновок про виявленого мікроба.

4. Далі кожний студент самостійно вивчає бактеріальні препарати-мазки із трепонем та борелій, досліджує їх в мікроскопі, замальовує мікроорганізми у протоколі, робить висновки.

3. . Заключний етап.

Викладач перевіряє оформлення протоколу та в індивідуальній бесіді з кожним студентом встановлює кінцевий рівень набутих знань з основних і найбільш важливих теоретичних та практичних питань. Далі викладач повідомляє кожному студенту про загальну оцінку його підготовки та роботи на занятті, виставляє оцінку у журнал обліку відвідувань і успішності студентів і інформує студентів про тему та план наступного практичного заняття, особливості підготовки.

Староста групи заносить оцінки у відомість обліку успішності і відвідування занять студентами, а викладач завіряє їх своїм підписом.

3. Додатки:

Додаток 1. Матеріали для самоконтролю студентів.

• Яке положення в системі мікроорганізмів займають патогенні звивисті бактерії?

• На які групи поділяють патогенні для людини спірохети?

• Історичні дані про збудників поворотного тифу, сифілісу та лептоспірозів?

• У чому полягають біологічні особливості збудників спірохетозів та критерії диференціації їх від сапрофітних мікроорганізмів такої ж морфології?

• Які є форми поворотного тифу, переносники та патогенез хвороби?

• Патогенез, клінічні форми сифілісу, імунітет.

• Які біологічні властивості у лептоспір?

• Патогенез, клінічні форми, імунітет, специфічна профілактика лептоспірозу, імунітет, специфічна профілактика.

• Який механізм імунітету при захворюваннях, викликаних трепонемами, бореліями та лептоспірами?

• Як можна обґрунтувати принципи мікробіологічної діагностики спірохетозів, лептоспірозів, гелікобактеріозів, кампілобактеріозів і які методи діагностики застосовують?

• Яке теоретичне обґрунтування терапії та профілактики спірохетозів, лептоспірозів, гелікобактеріозів і кампілобактеріозів?

Додаток 2. Тестові завдання до заняття по темі “Спірохетози”

І варіант	І варіант
1. Для культивування патогенноїTreponemapallidumпроводять? Посів на сироватковий агар Посів на яєчне середовище Левенштейна-Йенсена Інфікування кролів у яєчко Інфікування мишей внутрішньовенно Інфікування клітинних культур	2. Для серологічної діагностики сифілісу використовують? Реакцію Відаля Реакцію Вассермана Реакцію Райта Реакцію Хедельсона Реакцію Манту
3. При первинному сифілісі основним методом діагностики є ? Серологічний Бактеріологічний Алергічний Біологічний Бактеріоскопічний	4. При нейросифілісі основним методом діагностики є ? А. Серологічний В. Бактеріологічний С. Алергічний Д. Біологічний Е. Бактеріоскопічний
5. Для вивчення рухливості патогенних спірохет застосовують? Метод « висячої» краплі Імерсійну мікроскопію Метод «роздавленої» краплі Темнопольну мікроскопію Люмінесцентну мікроскопію	6. Для морфології спірохет характерно? Наявність периплазматичних джгутиків Розташування джгутиків по всій поверхні клітини Наявність 1 джгутика на одному полюсі спірохети Наявність пучка джгутиків на одному полюсі спірохети Е. Наявність пучка джгутиків на двох кінцях
7. Який метод використовується для фарбування патогенних спірохет? За Лефлером За Нейсером За Грамом За Романовським-Гімза За Цілем-Нільсеном	8. Якиймеханізм передачіповоротного тифу? Статевий Повітряно-крапельний Аліментарний Фекально-оральний Трансмісивний
9.Збудником епідемічногоповоротного тифу є ? А. Borrelia duttonii В. Borrelia recurrentis С. Borrelia typhy Д. Borrelia burgdorferi Е. Borrelia persica	10. Який тест найбільш широко використовують в діагностицілептоспірозів? А.Виділення гемокультури В.Виявлення збудника мікроскопією С. Біологічнапроба на кролях Д. Реакція іммобілізації лептоспір Е. Виділення урінокультури

ІІ варіант	ІІ варіант
1.Для серологічної діагностики сифілісу використовують? А. Реакцію Відаля В. Реакцію Вассермана С. Реакцію Райта Д. Реакцію Хедельсона Е. Реакцію Манту	2. Для культивування патогеннихTreponemapallidumпроводять ? А. Посів на сироватковий агар В. Посів на яєчне середовище.Левенштейна-Йенсена С. Інфікування кролів у яєчко Д. Інфікування мишей внутрішньовенно Е. Інфікування клітинних культур.
3. Для вивчення рухливості патогенних спірохет застосовують ? А. Метод висячої краплі В. Імерсійну мікроскопію С. Метод роздавленої краплі Д. Темнопольну мікроскопію Е. Люмінесцентну мікроскопію	4. При нейросифілісі основним методом діагностики є ? А. Серологічний В. Бактеріологічний С. Алергічний Д. Біологічний Е. Бактеріоскопічний
5. При первинному сифілісі основним методом діагностики є ? А. Серологічний В. Бактеріологічний С. Алергічний Д. Біологічний Е. Бактеріоскопічний	6 . Збудником епідемічного поворотного тифу є ? А. Borrelia duttonii В. Borrelia recurrentis С. Borrelia typhy Д. Borrelia burgdorferi Е. Borrelia persica
7.Який тест найбільш широко використовують в діагностицілептоспірозів? А.Виділення гемокультури В.Виявлення збудника мікроскопією С. Біологічнапроба на кролях Д. Реакція іммобілізації лептоспір Е. Виділення урінокультури	8.. Якиймеханізм передачіповоротного тифу? А. Статевий В. Повітряно-крапельний С. Аліментарний Д. Фекально-оральний Е. Трансмісивний
9. Для морфології спірохет характерно? А. Наявність периплазматичних джгутиків В. Розташування джгутиків по всій поверхні клітини С. Наявність 1 джгутика на одному полюсі спірохети Д. Наявність пучка джгутиків на одному полюсі спірохети Е. Наявність пучка джгутиків на двох кінцях	10. Який метод використовується для фарбування патогенних спірохет? А. За Лефлером В. За Нейсером С. За Грамом Д. За Романовським-Гімза Е. За Цілем-Нільсеном

ІІІ варіант	ІІІ варіант
1. При нейросифілісі основним методом діагностики є? А. Серологічний В. Бактеріологічний С. Алергічний Д. Біологічний Е. Бактеріоскопічний	2. Для вивчення рухливості патогенних спірохет застосовують ? А. Метод висячої краплі В. Імерсійну мікроскопію С. Метод роздавленої краплі Д. Темнопольну мікроскопію Е. Люмінесцентну мікроскопію
3. Для фарбування патогенних спірохет використовують методи А. За Лефлером В. За Нейсером С. За Грамом Д. За Романовським-Гімза Е. За Цілем-Нільсеном	4. Для культивування патогенноїTreponemapallidumпроводять? А. Посів на сироватковий агар В. Посів на яєчне середовище Левенштейна-Йенсена С. Інфікування кролів у яєчко Д. Інфікування мишей внутрішньовенно Е. Інфікування клітинних культур
5. Для серологічної діагностики сифілісу використовують ? А. Реакцію Відаля В. Реакцію Вассермана С. Реакцію Райта Д. Реакцію Хедельсона Е. Реакцію Манту	6. Який тест найбільш широко використовують в діагностицілептоспірозів? А.Виділення гемокультури В.Виявлення збудника мікроскопією С. Біологічнапроба на кролях Д. Реакція іммобілізації лептоспір Е. Виділення урінокультури
7. При первинному сифілісі основним методом діагностики є ? А. Серологічний В. Бактеріологічний С. Алергічний Д. Біологічний Е. Бактеріоскопічний	8. .Збудником епідемічного зворотного тифу є ? Borrelia duttonii Borrelia recurrentis Borrelia burgdorferi Д. Borrelia persica Е. Borrelia typhy
9. Якиймеханізм передачіповоротного тифу? А. Статевий В. Повітряно-крапельний С. Аліментарний Д. Фекально-оральний Е. Трансмісивний	10.Для морфології спірохет характерно? А. Наявність периплазматичних джгутиків В. Розташування джгутиків по всій поверхні клітини С. Наявність 1 джгутика на одному полюсі спірохети Д. Наявність пучка джгутиків на одному полюсі спірохети Е. Наявність пучка джгутиків на двох кінцях

Коди відповідей на тему “Лабораторна діагностика спірохетозів”

І варіант	ІІ варіант	ІІІ варіант
1 – С	1 – В	1 – А
2 - В	2 - С	2 - С
3 – Е	3 – С	3 – Д
4 – А	4 – А	4 – С
5 – С	5 – Е	5 – В
6 – А	6 – В	6 – А
7 – Д	7 – А	7 – Д
8 – Е	8 – Е	8 – В
9 – В	9 – А	9 – Е
10 - А	10 - Д	10 - А

3. Рекомендована література.

Основна:

1. Воробьёв А. А., Кривошеин Ю. С., Широбоков В. П. Медицинская и санитарная микробиология: учеб. пособие.— М., 2008, С. 224-234.

2. Климнюк С. І, Ситник І. О., Творко М. С., Широбоков В. П. – Практична мікробіологія.-Тернопіль, „Укрмедкнига”, 2004, С. 5-33.

3. Широбоков В.П., Янковський Д.С., Димент Г.С. Мікробна екологія людини з кольоровим атласом. Навчальний посібник.— К., 2009.-312 с.

4. Палій Г. К., Палій В. Г., Мруг В. М. Мікробіологія, вірусологія, імунологія, інфекційні хвороби. Словник / За ред. Г. К. Палія, В. Г. Палія.-Київ: Здоров’я, 2004. 196 с.

5. Борисов Л.Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология: М.:ООО едицинское информ. агентство, М., 2002, 734 с.

6. Данілейченко В.В., Федечко Й.М., Снітинська О.С. та інші. Медична мікробіологія, вірусологія, імунологія. Львів, 2002, 343 с

7. Красильников А. П. Микробиологичексий словарь-справочник. — Минск, 1986.

Додаткова:

1. Medical microbiology / edited by Samuel Baron, MD. – 4^th ed. The University of Texas Medical Branch and Galveston, 1996, 1273 p.

2. W.Levinson, E.Jawetz. Medical microbiology and immunology: examination and board review, 6^th ed. The McGraw-Hill Companies, 2000, 582 p.