obshaja_cytologija

зоне центромер. Но при этом пары сестринских хроматид каждой гомологичной хромосомы остаются соединенными между собой в центромерных районах и по всей длине. В это время сестринские хроматиды отчетливо выявляются в световом микроскопе. По мере отталкивания хромосом в бивалентах хорошо видны хиазмы – места перекреста и сцепления хромосом. Только в этих участках сохраняется структура синаптонемального комплекса ; в разошедшихся районах он исчезает. Расположение хиазм может быть различным у разных видов на разных хромосомах. Более длинные хромосомы имеют больше хиазм, чем короткие, но и самые короткие могут иметь одну хиазму на бивалент. Если имеется одна точка контакта, то бивалент приобретает вид креста, если две – то вид петли или ряда петель, если хиазм больше двух (рис. 340).

В диплотенной стадии происходит некоторое укорачивание и конденсация хромосом, в результате чего отчетливо выявляется их 4-нитчатая структура. В зоне хиазм при этом видно, что в перекрест вовлекаются только две хроматиды из четырех – по одной от каждого гомолога (рис. 341).

На этой стадии хромосомы приобретают вид «ламповых щеток» (см. рис. 104). На выделенных хромосомах этой стадии видно, что каждый гомолог в биваленте окружен как бы войлоком, состоящим из петлистых нитчатых структур. При этом было обнаружено, что петли парносимметричны, и каждая пара отходит от хромомера, расположенного на хромосомной оси. Эта ось не что иное, как две спаренные сестринские хроматиды, а хромомеры – это двойные участки конденсированного хроматина, петли же представляют собой деконденсированные участки активного, функционирующего хроматина. Характерным является то, что они содержат большие количества РНК, которая здесь же и синтезируется. Эта РНК относится по своим характеристикам к информационной.

Наличие активных хромосом в диплотене резко отличает мейоз от митоза, где, начиная с профазы, полностью прекращается синтез РНК. Активация транскрипции в пахитене и особенно в диплотене часто совпадает с ростом

421

формирующихся половых клеток, что особенно характерно для ооцитов. Как раз в это время клетка интенсивно синтезирует и запасает белки, необходимые для обеспечения ранних стадий развития зародыша. Для этого происходит синтез огромного количества рибосом на амплифицированных ядрышках и информационной РНК на боковых петлях хромосом.

Диакинез характеризуется уменьшением числа хиазм, укорочением бивалентов, потерей ядрышек. Биваленты приобретают более компактную форму, места соединения гомологичных хромосом оказываются расположенными на их концах терминально. Хромосомы теряют связи с ядерной оболочкой. Эта стадия является переходной к собственно делению клетки. В метафазе I деления мейоза биваленты выстраиваются (как и полагается для метафазы) в экваториальной плоскости веретена.

В анафазе I деления совершается еще одно важнейшее событие – расхождение хромосом. Но, в отличие от митоза, расходятся не сестринские хроматиды, а гомологичные хромосомы, состоящие из двух сестринских хроматид (рис. 342). Если оценивать события этой фазы, то видно, что при анафазе по разным клеткам расходятся аллельные гены, располагающиеся в разных гомологах. Распределение же гомологов по клеткам совершенно случайное, так что происходит смешение, перекомбинация хромосом из разных пар. Если оценивать образовавшиеся хромосомные наборы, от оба они содержат по 2с количества ДНК и по 2n числа хроматид, ибо каждая хромосома в паре гомологов состоит из двух хроматид. В этом отношении редукции числа хромосом (хроматид) еще не произошло, но в два раз произошло уменьшение генетической разнородности, так как теперь в каждом хромосомном наборе нет аллельных генов.

Вслед за телофазой I деления следует короткая интерфаза, в которой не происходит синтеза ДНК, и клетки приступают к следующему делению, которое по морфологи и последовательности не отличается от митотического деления: парные сестринские хроматиды, связанные в центромерных участках, проходят

422

профазу и метафазу; в анафазе они разъединяются и расходятся по одной в дочерние клетки. Таким образом, при II мейотическом делении клетка с 2с количеством ДНК и 2n числом хроматид, делясь, дает начало двум клеткам с гаплоидным содержанием ДНК и хромосом. В отношении числа структурных единиц, хроматид, II деление мейоза является редукционным. Однако термин «редукционный» употребляется также и в общегенетическом смысле и относится к расщеплению аллелей, и в этом смысле редукционным является I деление мейоза, когда в клетки попадает по одной из аллелей (рис. 343).

В результате всего процесса мейоза после двух делений из одной клетки образуются четыре гаплоидных, каждая из которых отличается по своей генетической конституции (рис. 344).

Как во время митоза, так и при расхождении хромосом в I и II делении мейоза происходит случайное распределение хромосом по дочерним клеткам. Это и создает генетическое разнообразие в возникающих гаплоидных половых клетках. Так, например, в диплоидных клетках с числом хромосом равным двум после мейоза образуется 4 различные клетки. Т.е. число вариантов будет равно 2n. У человека же после меойза может возникнуть несколько миллионов различающихся клеток, даже если будет исключен кроссинговер, который увеличит это разнообразие еще во много раз.

Завершение мейоза для мужских и женских гоноцитов различное. При мейозе сперматогониев возникают 4 одинаковых по размеру сперматоцита, которые затем дифференцируются в сперматозоиды.

При мейозе оогоний картина иная. Первое деление созревания ( I мейотическое деление) приводит к тому, что от большого ооцита отделяется мелкая клетка – направительное тельце. При II делении происходит также неравное деление: от ооцита отделяется второе направительное тельце, а первое также делится. Поэтому возникают четыре клетки: крупная зрелая яйцеклетка и три мелких направительных тельца, которые быстро дегенерируют.

423

Глава 26. Регуляция клеточного цикла

Клеточный цикл представляет собой однонаправленный процесс, где клетка последовательно проходит разные его периоды, без их пропуска или возврата к предыдущим стадиям. Вступив в клеточный цикл, клетка его заканчивает синтезом ДНК и делением клетки (рис. 345).

Однако, как уже говорилось, клетки могут выходить из цикла, переходить в стадию покоя, или в G0-стадию. В многоклеточных организмах многие клетки теряют способность к пролиферации, к размножению, теряют способность переходить из стадии покоя в первую стадию пролиферации, в G1-стадию, которая начинает путь клетки к ее делению. К таким клеткам относятся нейроны, кардиомиоциты, клетки хрусталика и многие другие. Существуют также органы с редко делящимися клетками; так, например, клетки печени могут входить в клеточный цикл через несколько месяцев покоя. Быстро размножающиеся клетки взрослых организмов, такие как кроветворные, или базальные клетки эпидермиса и тонкой кишки могут входить в клеточный цикл каждые 12-36 часов. Самые короткие клеточные циклы, около 30 мин, наблюдаются при быстром дроблении яиц низших организмов (иглокожие, земноводные). В экспериментальных условиях короткий (20 час) клеточный цикл имеют многие линии клеточных культур.

Что определяет вступление клеток в пролиферацию и что определяет закономерную последовательность смены периодов клеточного цикла – эти вопросы долгое время оставались без ответа.

Считалось, что для начала вступления в клеточный цикл необходим рост живой массы клетки, образование веществ для деления, в частности ДНК и белка, создания определенного уровня энергетических запасов и т.д.

Фактор стимуляции митоза Расшифровка регуляции процессов клеточного деления началась в 70е годы

прошлого века, когда были найдены методы слияния разных клеток, методы получения гетерокарионов (о них см. главу 2). Оказалось, что можно получить

424

слияние не только интерфазных клеток с интерфазными, но и интерфазных с митотическими клетками (рис. 114). При этом обнаружилось удивительное удивительное явление: в такой гибридной клетке, где были митотические хромосомы одной из исходных клеток, в ядрах от интерфазных клеток начиналась конденсация хромосом, разрушалась ядерная оболочка и образовывались т.н. преждевременно конденсированные хромосомы (ПКХ или РСС – preliminary condenced chromosomes). Причем структура ПКХ зависела от стадии интерфазного ядра: в ядре от G1 клетки появлялись однонитчатые длинные ПКХ, в ядре от G2 клетки ПКХ были двойными (т.к. после S-периода хромосомы удвоились). Эти наблюдения наводили на мысль, что при слиянии таких клеток на интерфазные ядра действуют какие-то факторы, содержащиеся в митотических клетках.

Для проверки этого предположения были поставлены опыты со слиянием клеток на разных стадиях клеточного цикла (см.табл.)

Таблица. Результаты слияния клеток на разных стадиях (G1, S, G2 ,M) клеточного цикла

Эти эксперименты были дополнены тем, что часть цитоплазмы митозной клетки инъецировали в цитоплазму G1-интерфазной клетки. Это приводило к появлению в ядре интерфазной клетки ПКХ. Из этих наблюдений был сделан ввод о том, что в цитоплазме митотической клетки есть фактор (или факторы), стимулирующие митоз (ФСМ или MPF – mitosis promoting factor). Этот фактор вызывает не только конденсацию хромосом, но и приводит к распаду ядерной

425

оболочки, т.е. переводит интерфазную клетку, даже без синтеза ДНК, в митотическое состояние (конечно, дальше появления конденсированных хромосом развитие митоза не идет).

Параллельно с этими наблюдениями были проведены эксперименты на созревающих и дробящихся яйцеклетках лягушек X.laevis (рис. 346).

Ооцит X.laevis после репликации ДНК и короткой G2–стадии переходит в мейотическую профазу I, во время которой в течение 8 месяцев происходит рост и созревание ооцита, он дорастает до размера зрелой икринки. При спаривании овариальные клетки самки выделяют гомон прогестерон, который стимулирует переход из профазы в I мейотическое деление (митоз I), затем после короткой интерфазы наступает II мейотическое деление, которое на некоторое время останавливается на стадии метафазы (стадия яйца). При оплодотворении спермием метафаза завершается, происходит второе деление меойза, после чего гаплоидное ядро яйцеклетки сливается с ядром спермия, и образуется диплоидная зигота. После этих событий следуют через каждые 30 мин многочисленные деления клеток развивающейся бластулы (рис. 346а).

Если взять с помощью микроманипулятора небольшую часть цитоплазмы из ооцита на стадии метафазы II мейотического деления и инъецировать ее в цитоплазму не стимулированного прогестероном ооцита, то произойдет повторение описанного выше процесса: ооцит вступит в I деление мейоза, а затем и во II деление, т.е. произойдет его созревание (рис. 346в). Таким образом было найдено, что в ооците на стадии метафазы II деления в цитоплазме существует фактор (или факторы), стимулирующие созревание яйцеклетки (ФСС или MPF – maturation promoting factor).

Оказалось, что этот фактор (будем называть его MPF) присутствует в клетках только во время митотического состояния. Он обнаруживается также и во время дробления яйцеклетки (рис. 347). Таким образом, уровень MPF в интерфазных клетках низкий, а в митотических высокий.

426

Далее было найдено, что при инъекции цитоплазмы из митотических клеток культуры ткани в нестимулированный ооцит X. laevis, происходит созревание ооцита. Следовательно, фактор, стимулирующий митоз и фактор, стимулирующий созревание ооцитов – одно и тоже.

Этот фактор, MPF, был выделен и охарактеризован. Это гетеродимерный комплекс, состоящий из белка циклина (см. ниже) и зависимой от циклина протеинкиназы (Cyclin dependent kinase – Сdk), фермента, относящегося к фосфорилазам, который модифицирует белки, перенося фосфатную группу от АТФ на аминокислоты серин и треонин. Следовательно, MPF состоит из двух субъединиц: каталитической (Сdk) и регуляторной (циклин) (рис. 348).

Циклины Циклин был обнаружен при изучении включения меченых аминокислот в

синхронно дробящиеся яйца морского ежа. Было обнаружено, что в одном из белковых пиков на электрофореграммах метка периодически то появляется, то исчезает: она появлялась после клеточного деления, постепенно возрастала к митозу, а затем ее уровень падал после анафазы, и потом снова начинал возрастать в следующей интерфазе. Этот белок был назван циклином. Он постоянно синтезируется в течение эмбрионального клеточного цикла и резко разрушается при вступлении в анафазу. Подобный митотический циклин В был обнаружен у всех эукариот, в том числе и у X. laevis.

В раннем эмбриогенезе, т.е. при дроблении яиц X. laevis, первые 12 делений идут друг за другом при минимальной величине G1 и G2 периодов, и возрастание уровня MPF происходит во время каждого деления. Интересно, что дробление яиц и циклические изменения активности MPF происходят также без участия ядер. Это значит, что для появления активности MPF не нужна транскрипция информационных РНК. В этот период все клеточные белковые синтезы идут на долгоживущих матричных РНК, синтезированных еще во время роста ооцитов в мейотической профазе.

427

Расшифровка природы активности MPF была получена на модельных экспериментах с использованием цитоплазматических экстрактов активированных яиц X. laevis. В этих экстрактах были все компоненты для поддержания клеточного цикла: ферменты и предшественники для синтеза ДНК, гистоны и другие белки и липиды для образования ядерной оболочки, так же как и мРНК, необходимая для синтеза белков, и в том числе циклина В.

Если к такому экстракту добавить хроматин из спермиев X. laevis, то вокруг хроматина образуется ядерная оболочка, затем происходит синтез ДНК, следует конденсация хромосом, разрушается ядерная оболочка, образуется митотическая фигура, и потом наступает интерфаза, и цикл повторяется через каждые 20 мин снова и снова. По мере прохождения каждого цикла происходило сначала нарастание циклина В в интерфазе параллельно возрастанию активности MPF. В митозе после анафазы количество циклина В и активность MPF падали, т.е. происходило циклическое изменение двух параметров (рис. 349). По мере возрастания уровня MPF при повышении активности Сdk происходила конденсация хромосом за счет фосфорилирования конденсинов и гистона Н1, распад ядерной оболочки при фосфорилировании ламинов, образование веретена деления, т.е. все атрибуты митотического аппарата.

Подавление синтеза белка циклогексимидом или разрушение всей mРНК с помощью РНК-азы полностью снимало циклику MPF и циклина В. Если после действия РНК-азы и при последующем ее удалении ввести в экстракты mРНК только для циклина В, то периодические изменения уровней MPF и циклина В восстанавливаются (рис. 349в). Эти данные говорят о том, что в системе MPF только циклин В синтезируется в интерфазе и деградирует в анафазе. В то время как второй компонент, а именно протеинкиназа Сdk существует долгое время и активируется при появлении циклина В.

Деградация циклина В в анафазе вызывается сложной цепочкой белковых взаимодействий, которая приводит к его расщеплению с помощью сложных белковых протеолитических комплексов – протеосом. Кроме того, в начальных

428

этапах деградации циклина участвует сложный белковый комплекс АРС (комплекс стимулирующий анафазу), который не только подготавливает циклин к деградации, но одновременно приводит к деградации когезинов, удерживающих хроматиды друг с другом вплоть до анафазы.

Общая схема регуляции митотического циклина В и MPF в циклирующих клетках может быть представлена на рис 350.

Регуляция клеточного цикла у млекопитающих На предыдущей схеме рассмотрены только конечные звенья цепи событий,

заканчивающихся делением клетки. Однако, как уже говорилось, деление клетки обязательно связано с репликацией ДНК. Следовательно, должны существовать механизмы, регулирующие запуск синтеза ДНК, а этому должны предшествовать события G1-периода, подготавливающие начало S–периода. Оказалось, что комплексы Сdk - митотический циклин В – это только конечный этап регуляции клеточного цикла. На самом же деле от начала вхождения в клеточный цикл до его завершения в клетке работает каскад комплексов Сdkциклин. Так, у дрожжей один и тот же Сdk отвечает за прохождение цикла, но на разных его стадиях он взаимодействует с разными циклинами, характерными для каждой стадии клеточного цикла.

У млекопитающих в реализации всего цикла участвуют 9 различных циклинов и 7 разных Сdk (рис. 351). Но что является пусковым механизмом для вхождения клеток в цикл из состояния покоя, из G0-стадии? Мы видели, что для активации клеточного цикла ооцита X. laevis необходимо первоначальное воздействие гормона прогестерона, который в данном случае является фактором роста (ФР или GF) или пролиферации.

Было найдено, что существует множество факторов роста, побуждающих клетки к размножению. Они могут быт собственными продуктами данных клеток (аутокринная стимуляция) или других соседних (паракринная стимуляция), или даже клеток других органов (гормональная стимуляция). Так, например, фактор роста из тромбоцитов (PDGF) стимулирует пролиферацию

429

клеток соединительной ткани, эпидермальный ФР (EGF) стимулирует размножение многих типов клеток, работает как сигнальный белок при эмбриональном развитии; ФР нервов (NGF) вызывает рост отдельных типов нейронов; эритропоэтин вызывает пролиферацию предшественников эритроцитов и т.д.

Хорошим примером зависимости пролиферации клеток от факторов роста могут служить клеточные культуры. Было найдено, что для размножения многих клеточных культур, кроме питательных сред, необходимо добавление сывороток крови или эмбриональных экстрактов. Оказалось, что именно в этих добавках содержатся ФР. Без них клетки переходят в G0-стадию, а затем погибают. Для роста нервных клеток в культуре требуется добавление в среду фактора роста нервов (NGF).

Эти разные ФР связываются на поверхности клеток со своими рецепторами и передают сигнал через вторичные мессенджеры (например, цАМФ) на систему внутриклеточного каскада протеинкиназ (фосфорилаз), связанных с запуском клеточного цикла. Сначала активируются гены раннего ответа, белки которых индуцируют транскрипцию генов отложенного ответа, некоторые из них сами являются факторами транскрипции, а также индуцируют синтез некоторых циклинов и cdk, которые отсутствовали в G0-периоде.

Так, вначале синтезируются белки Сdk и циклины, характерные для G1- стадии, затем для S-фазы и потом для митоза (рис. 352). В G1-стадии комплекс Сdk-циклин (G1- CDK) фосфорилирует факторы транскрипции, необходимые для активации экспрессии генов, ответственных за образование синтетического комплекса S-CDK, который после образования инактивируется специальным ингибитором. В конце G1-периода комплекс G1 - CDK фосфорилирует этот ингибитор, который отделяется от комплекса S-CDK, тем самым его активируя. При этом в первоначальном комплексе G1--CDK циклин деградирует. Активированный S-CDK комплекс индуцирует S-фазу, фосфорилируя белки регуляторного участка ДНК, связанных с точками начала репликации. После

430