Ординатура / Хирургия / Библиотека им академика М.И. Перельмана / Книга_2988_Библиотеки_им_академика_М_И_Перельмана

ДИАГНОСТИКА

электронно-оптической техники. В связи с этим биолюминесцентные реакции чрезвычайно чувствительны. Пределы обнаружения АТФ и НАДН составляют соответственно 10-17 и 10-19 моль/л. Биолюминесцентный метод анализа НАДН обладает в 25 000 раз более высокой чувствительностью по сравнению со спектрофотометрией. Во-вторых, в основе светоизлучения лежат ферментативные реакции, что определяет высокую специфичность метода. В-третьих, около 20% всех известных ферментов являются АТФ- и НАД(Ф)-зависимыми. Это позволяет определять концентрацию различных метаболитов и широкого спектра ферментов, характеризующих самые разные метаболические процессы. В-четвер- тых, экспрессность и высокая чувствительность метода позволяют проводить исследования в микрообразцах биологического материала с минимальным количеством реактивов и времени.

Са2+-регулируемые фотопротеины на сегодняшний день обнаружены более чем у 25 различных кишечнополостных (Haddock S.H. et al., 2010). Среди них наиболее изучены акворин и обелин, ДНК, кодирующая эти белки, была клонирована и с высоким выходом экспрессирована в бактериальных клетках (Frank L.A., 2010). Рекомбинантные фотопротеины всесторонне изучены по биохимическим и биофизическим свойствам, третичной структуре и механизму биолюминесценции. В частности, описана разработка твердофазного биолюминесцентного иммуноанализа гормонов щитовидной железы (Frank L.A. et al., 2004). В качестве биолюминесцентной метки используется рекомбинантный обелин. Для получения конъюгатов обелина с иммуноглобулинами, специфичными к тиреотропному гормону (ТТГ) и тироксину (Т4), в молекулу фотопротеина вводили дополнительные SH-группы, а затем конъюгировали обелин с сукцинимидил-4- (N-малеимидометил) циклогексан-1-карбоксилат-активированными молекулами специфических иммуноглобулинов. Общий выход конъюгатов обелина, определенный по люминесцентной активности, после всех химических процедур и процедур очистки составлял 60–65%. Полученные конъюгаты были устойчивы к лиофилизации и в растворе не менее 9 мес при температуре 4 оС, потеря активности не превышала 10%. Применение конъюгатов обелина для определения ТТГ, общего Т4 и свободного Т4 в стандартных, контрольных и в сыворотках пациентов показывала высокую чувствительность и воспроизводимость результатов (Frank L.A. et al., 2004).

Hallett M.B. и Campbell A.K. (1983) с помощью обелина провели прямое измерение нутриклеточного свободного Ca2+ в перитонеальных макрофагах крыс. Было установлено, что макрофаги, нагруженные фотопротеионом, в состоянии покоя имели внутриклеточную концентрацию Ca2+ в 0,24±0,02 мкМ. Ионофор кальция А23187 вызывал длительное повышение внутриклеточного Ca2+, а также стимулировал выработку кислородных радикалов, что контролировалось с помощью люминолзависимой хемилюминесценции. Хемотаксический пептид

320

https://t.me/medicina_free

ДИАГНОСТИКА

(N-формил-метионил-лейцил-фенилаланин) в концентрации 1 мкМ вызывал временное увеличение цитоплазматического Ca2+, которое достигало плато на уровне 1,2±0,64 мкМ и снижалось с периодом полувыведения примерно в 40 с. Неопсонизированные латексные частицы (диаметром в 1 мкм) не вызывали ка- кого-либо заметного повышения внутриклеточного Ca2+. Включение хелатора кальция EGTA-ethylene-glycol-bis-(aminoethylether) tetra-acetate в цитоплазму устраняло транзиторное внутриклеточное повышение Ca2+, индуцированное хемотаксическим пептидом. Также было прекращено производство кислородных радикалов. Однако внутриклеточная ЭГТА не влияла на продукцию кислородных радикалов, индуцированную неопсонизированными частицами. Был сделан вывод, что выработка кислородных радикалов, обнаруженная с помощью хемилюминесценции, может быть вызвана повышением внутриклеточного Ca2+.

Люцифераза светляков представляет собой мономер с молекулярной массой около 60 кДа, который способен димеризоваться при высокой концентрации. Утверждается, что люцифераза светляков, кроме люминесцентной, способна проявлять и другие многочисленные ферментативные функции, но любая ее функция всегда реализуется за счет активации АТФ-связывающего сайта (Thorne N. et al., 2010). В состав люциферазы Photinus pyralis входит большое число гидрофобных аминокислот. Это объясняет высокую склонность фермента к образованию агрегатов, особенно при низких значениях ионной силы. Так, подобно белкам мембран, люцифераза может образовывать ассоциаты с фосфолипидами. SH-группа, играющая роль в катализе, имеет гидрофобное окружение и находится вблизи люциферин-связывающего участка. Многие гидрофобные соединения являются ингибиторами люциферазы, конкурентными по отношению к люциферину, а аналоги АТФ — неконкурентыми (Haubrich B.A. et al., 2020).

Методы определения АТФ с использованием люциферин-люциферазной системы светляков широко используются во многих областях медицины и биологии. Чувствительность метода достигает 10-17 моля АТФ в образце. На основе иммобилизованной люциферазы светляков разработаны методы определения таких ферментов, как креатинфосфокиназа, пируваткиназа, АТФаза, АТФсульфгидролаза (Савченко А.А., Борисов А.Г., 2012; Lomakina G.Y., Ugarova N.N., 2022).

В работе Yu. Lomakina G., Ugarova N.N. (2022) показано влияние мембраноактивного антибиотика колистина на живые клетки, для чего были использованы рекомбинантные клетки Escherichia coli, экспрессирующие термостабильную люциферазу светлячка Luciola mingrelica. АТФ-зависимая люцифераза оказалась информативным белковым маркером для выявления необратимых изменений проницаемости клеточных мембран. Изучение кинетики внутри- и внеклеточной концентрации АТФ при различном содержании колистина показало, что скорость снижения внутриклеточной концентрации АТФ значительно

321

https://t.me/medicina_free

ДИАГНОСТИКА

превышала скорость накопления внеклеточной концентрации АТФ. Этот факт нельзя было объяснить только высвобождением АТФ из клетки с увеличением проницаемости наружной клеточной мембраны под действием колистина. Авторами предположено, что потеря значительной части внутриклеточного АТФ в присутствии колистина обусловлена снижением активности ферментов дыхательной цепи и АТФ-синтазы, приводящие к снижению скорости синтеза АТФ или даже до его остановки (Yu. Lomakina G., Ugarova N.N., 2022).

Вработе Lomakina G.Y., Ugarova N.N. (2022) рассмотрены возможности использования люциферин-люциферазной реакции, основанной на окислении D-люциферина кислородом в присутствии АТФ и ионов магния, для изучения влияния внешних эффекторов физической и химической природы (температурное воздействие, добавки лекарственных препаратов, мембраноактивных соединений и др.) на живые клетки (прокариоты и эукариоты). В исследовании представлено применение разработанного на базе химического факультета МГУ (Москва, Россия) набора реактивов, содержащего все необходимые компоненты для регистрации стабильного сигнала биолюминесценции, пропорционального

АТФ в широком диапазоне концентраций АТФ (коэффициент корреляции 0,99, предел обнаружения ~ 10 12 М АТФ) и подходит для повторных, долгосрочных

измерений АТФ в живых системах.

С помощью биолюминесцентной визуализации (использовали люциферазу светлячков) были изучены защитные эффекты мезенхимальных стволовых клеток, праймирующих ПГЕ2 (PGE2-MSC), при остром повреждении легких, вызванном липополисахаридами бактериального происхождения (Hezam K. et al., 2023). Установлено, что PGE2-MSC эффективно уменьшают повреждение легких и снижают общее количество клеток, нейтрофилов, макрофагов и уровень белка в жидкости бронхоальвеолярного лаважа. Лечение приводило к резкому уменьшению гистопатологические изменений и количества провоспалительных цитокинов, одновременно увеличивая количество противовоспалительных цитокинов (рис. 129). Кроме того, результаты подтверждали, что праймирование ПГЕ2 улучшало терапевтическую эффективность мезенхимальных стволовых клеток за счет поляризации макрофагов M2.

Висследовании Cao X. et al. (2022) представлена создание мышиной модели гепатоцеллюлярной карциномы путем одновременного нокаута генов-су- прессоров Pten и p53 и сверхэкспрессии протоонкогенов c-Met и ᶭ90-β-кате- нина. Мутации были введены с помощью транспозонных систем CRISPR/Cas9 и «Спящая красавица» (Sleeping Beauty transposon system — https://wiki5.ru /wiki/ Sleeping_Beauty_transposon_system). При этом были использованы макрофаги,

322

https://t.me/medicina_free

ДИАГНОСТИКА

Рис. 129. Схематическая диаграмма механизмов лечения с помощью мезенхимальных стволовых клеток, праймирующих простагландин Е2,

при остром повреждении легких, вызванном липополисахаридами бактериального происхождения

(по Hezam K. et al., 2023)

экспрессирующие промотор аргиназы-1 (Arg1) в сочетании с люциферазой светлячка, для биолюминесцентной визуализации микроокружения опухоли (Cao X. et al., 2022). Для этого макрофаги, полученные из костного мозга, были адоптивно перенесены от репортерных мышей Luc+ контрольным мышам и мышам с опухолями путем инфузии в хвостовую вену, а их распределение и миграцию контролировали с помощью биолюминесценции in vivo. Как показано на рис. 129 (А), интенсивная биолюминесценция наблюдалась в легких в течение 30 мин после инфузии как у контрольных мышей, так и у мышей с опухолями. Через 24 ч биолюминесценция у экспериментальных мышей была сконцентрирована в печени, тогда как у контрольных мышей биолюминесценция была слабой только в тонком кишечнике. Макрофаги Luc+ оставались в печени мышей с опухолями через 48 ч, тогда как макрофаги в контрольной группе мигрировали в селезенку и тонкий кишечник (см. рис. 130 А). Интенсивность биолюминесценции ex vivo паховых лимфатических узлов (ILN), подмышечных лимфатических узлов (ALN), подчелюстных лимфатических узлов (NLN), печеночных лимфатических узлов (LivLN), мезентериальных лимфатических узлов (MLN) и других органов

323

https://t.me/medicina_free

ДИАГНОСТИКА

или тканей через 48 ч также подтвердило, что макрофаги были в основном распределены в печени мышей с опухолями, тогда как макрофаги в

Рис. 130. Распределение макрофагов костномозгового происхождения в контрольной модели и мышиной модели с опухолями: (А) Миграция макрофагов в период от 30 мин до 48 ч после инъекции клеток. (B, C) Макрофаги в основном распределены в печени и селезенке мышей с опухолями. (D)

Статистический анализ активности люциферазы в основных органах мышей

контрольной группе в основном располагались во вторичных лимфатических узлах и селезенке (рис. 130, B и С). Статистика биолюминесценции основных органов представлена на рис. 130, D), что указывает на то, что активность биолюминесценции печени была самой сильной. Эти данные свидетельствуют о том, что инфильтрация макрофагов в микроокружение опухоли печени приводит к их поляризации к фенотипу М2, экспрессирующему Arg1.

324

https://t.me/medicina_free

ДИАГНОСТИКА

Сочетание стандартной лучевой терапии с иммунотерапией становится одним из основных направлений лечения НМРЛ. В исследовании Reijmen E. et al. (2021) продемонстрировано снижение роста опухоли и ряд иммунологических эффектов в диапазоне низких доз лучевой терапии. Изменение роста опухоли оценивали через биолюминесцентную визуализацию in vivo и иммуногистохимией in vitro. Установлено, что значительные иммунологические изменения, вызванные лучевой терапией, наблюдались в облученных легких и на периферии (в селезенке и крови). После лучевой терапии во всех оцениваемых тканях наблюдались значительное снижение количества CD8+ Т-клеток и тенденция к увеличению количества CD4+- и регуляторных Т-клеток. Примечательно, что только на периферии оставшиеся CD8+ Т-клетки демонстрировали более активированный фенотип. Кроме того, при лучевой терапии наблюдалось значительное увеличение количества нейтрофилов и моноцитов локально (в легких) и системно (в крови). Локально лучевая терапия увеличивала приток опухолеассоциированных макрофагов и обычных дендритных клеток второго типа, тогда как количество альвеолярных макрофагов и обычных дендриитных клеток первого типа резко уменьшалось. Данные АПК демонстрировали пониженный уровень экспрессию антигена CD86, что указывало на снижение способности индуцировать эффективный иммунный ответ. Описан метод определения цитотоксической активности CD8+ Т-клеток с помощью многоканального люминометра (Hayashi R. et al., 2022). Были выделены цитотоксические Т-лимфоциты из селезенки животного с меланомой. Цитотоксическую активность CD8+ Т-клеток оценивали в опытах in vitro при совместном культивировании Т-лимфоцитов и клеток меланомы, экспрессирующих светляковую люциферазу. Установлено, что с увеличением функциональной активности цитотоксических Т-лимфоцитов рост опухоли замедляется.

Инвариантные естественные киллерные Т-клетки (iNKT) обладают способностью обеспечивать мощную противоопухолевую реактивность и поэтому стали предметом внимания при разработке клеточной иммунотерапии. Клетки iNKT атакуют опухолевые клетки, используя несколько механизмов с высокой эффективностью. Однако их клиническое применение ограничено из-за их небольшого количества у онкологических больных и трудностей с проникновением в солидные опухоли. В исследовании Li Y.R. et al. (2022) при использовании α-GalCer (αGC — синтетический гликолипидный лиганд), специфически рекрутирующего iNKT в солидные опухоли, подобные ограничения преодолены. Путем адоптивного переноса клеток iNKT человека в гуманизированных мышей NSG с опухолями и введения однократной дозы локализованного в опухоли α-GalCer продемонстрировано быстрое привлечение клеток iNKT человека в солидные опухоли всего за один день и значительно повышенную способность лизировать опухолевые клетки. С использованием клеток iNKT, меченных люциферазой светлячка, проведен контроль биораспределения в тканях у мышей NSG

325

https://t.me/medicina_free

ДИАГНОСТИКА

с опухолями. В совокупности эти доклинические исследования демонстрируют перспективность иммунотерапии на основе клеток iNKT, управляемой αGC, для воздействия на солидные опухоли.

Оригинальный способ оценки микробного загрязнения различных сред разработали российские химики из МГУ им. Ломоносова (Москва, Россия). Чтобы обнаружить микробов, они заставляют их светиться с помощью той же химической реакции, которая дает свечение светлячкам. Этот метод экспрессанализа позволяет буквально пересчитать микробов в молоке, мороженом или же на стенах больничной палаты всего за несколько минут. Люминесценция осуществляется благодаря взаимодействию фермента люциферазы светляков с молекулой АТФ. Если оболочки микробных клеток разрушить, АТФ, содержащийся в них, окажется вне клеток, в растворе. Теперь, добавив в раствор люциферазу и необходимые реактивы, по интенсивности ее свечения можно определить количество микроорганизмов — стафилококков, сальмонеллы и т.д. Чем больше в пробе живых микробных клеток, тем сильнее будет светиться раствор. Создатели нового метода подчеркивают, что главное его преимущество — это его быстрота. Измерение АТФ занимает 1 мин, а на полный анализ образца в зависимости от длительности пробоподготовки требуется от 2 мин до 6 ч. Для сравнения: при традиционном способе оценки микробного загрязнения пробу помещают в питательную среду на несколько дней, пока микробы размножатся. Такой анализ длится от 24 до 72 ч. По-новому же методу «подращивать» микробы требуется только в редких случаях, когда их уж совсем мало, причем все равно на это требуется не больше 6 ч (https://elementy.ru/novosti_nauki/164642/Svetlyachki_pomogayut_obnaruzhit_vred nykh_mikrobov).

Светящиеся бактерии — самые мелкие и самые изученные из светящихся организмов — обитают в почве, в соленой и пресной воде. Среди них есть свободноживущие, но есть и те, которые живут в симбиозе с рыбами, крабами, нематодами и другими многоклеточными организмами или же являются их паразитами. Исследованные люминесцентные бактерии принадлежат к четырем родам:

Photobacterium, Beneckea (Vibrio), Alteromonas и Photorhabdus (Kudryasheva N.S., 2005).

Бактериальная люминесцентная реакция катализируется ферментом — бактериальной люциферазой (монооксигеназой) и включает в себя процесс окисления восстановленного флавинмононуклеотида ФМН-Н2 до ФМН и одновременно алифатического альдегида (С8–С14) до соответствующей жирной кислоты. Эта реакция протекает через стадию образования пероксида флавинмононуклеотида и приводит к голубовато-зеленой люминесценции с максимумом при 490 нм. В отличие от всех известных биолюминесцентных реакций, бактериальная проходит без образования углекислого газа. Бактериальная люцифераза

326

https://t.me/medicina_free

ДИАГНОСТИКА

представляет собой гетеродимер, состоящий из двух неидентичных субъединиц (α и ß), с молекулярной массой 40 кДа и 35–37 кДа соответственно. Активный центр локализован на α-субъединице (Yehia M.R. et al., 2022). На основе бактериальной биолюминесценции нами разработаны методы определения внутриклеточной активности широкого спектра НАД- и НАДФ-зависимых дегидрогеназ. Результаты представлены в различных публикациях и, в том числе в данной монографии.

Для выполнения методов био- и хемилюминесцентного анализа (см. ниже) был разработан биохемилюминесцентный анализатор БЛМ-3607М01 (ООО «МедБиоТех», Красноярск, Россия) (рис. 131.). Прибор БЛМ-3607 оснащен электронной системой управления и контроля параметров с помощью современных ПК.

Рис. 131. Общий вид прибора БЛМ-3607М01

Анализатор биохемилюминесцентный работает в режиме счета импульсов с автоматическим выбором диапазона измерения и с внутренней автоматической системой калибровки измерений. Программное обеспечение прибора позволяет провести одновременно измерение в 36 кюветах с определением следующих параметров:

создание файла и возможность обработки результатов измерения после проведения эксперимента;

327

https://t.me/medicina_free

ДИАГНОСТИКА

определение максимального значения интенсивности свечения;

определение на кривой время достижения максимального свечения;

определение константы спада интенсивности свечения;

определение скорости выхода на максимум свечения;

определение площади пика в относительных единицах;

цифровая фильтрация шумов кривых при обработке результатов измерения. Технические характеристики:

электропитание прибора осуществляется от однофазной сети переменного тока напряжением 220 вольт с частотой 49–51 Гц, с заземлением.

Исходя из сопряженной системы, на основе биферментной системы светящихся бактерий разработан биолюминесцентный метод по определению активности НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ в клетках иммунной системы (лимфоциты, нейтрофилы, моноциты, дендритные клетки):

НАД(Ф)Н+H++ФМН оксидоредуктаза НАД(Ф)+ФМН-H2+C14+O2 люцифераза hν,

где ФМН — флавинмононуклеотид, С14 — миристиновый альдегид, hν — квант света.

Выделенные клетки подсчитывали и раствором Хенкса доводили до уровня 1 млн/мл. Клетки разрушали путем осмотического лизиса (1:5 по объему) с добавлением дитиотреитола 2,0 мМ. Данным методом определяли активность следующих ферментов: лактатдегидрогеназы (ЛДГ, EC 1.1.1.27), НАД-зависи- мой малатдегидрогеназы (МДГ, EC 1.1.1.37), НАДФ-зависимой декарбоксилирующей малатдегидрогеназы (НАДФ-МДГ, EC 1.1.1.40), НАД-зависимой изоцитратдегидрогеназы (НАД-ИЦДГ, ЕС 1.1.1.41) и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы

328

https://t.me/medicina_free

ДИАГНОСТИКА

(Г6ФДГ, ЕС 1.1.1.49). Для этого 50 мкл суспензии разрушенных клеток добавляли в кювету люминометра к 150 мкл инкубационной смеси, содержащей соответствующий субстрат в концентрации 10-5–10-2 М и кофермент в концентрации 10-6–10-2 М при рН 5,5–10,4 (0,1 М К+, Na+-фосфатном или трис-HCl-буфере). После инкубации при 37 оС в течение 30 мин к 200 мкл инкубационной смеси добавляли по 50 мкл 0,005% миристинового альдегида и 1,5×10-5М ФМН и НАД(Ф):ФМНоксидоредуктаза-люциферазы (все реактивы биолюминесцентной смеси разводились в 0,1 М К+, Na+-фосфатном буфере с рН 7,0). Измеряли уровень биолюминесценции и при помощи калибровочной кривой определяли активность ферментов. Учитывая, что в клетках имеются субстраты для течения различных ферментативных реакций с наработкой НАД(Ф)H, определяли условно названный субстратный фон. Определение производили в тех же условиях, но в инкубационную смесь вместо соответствующего субстрата вносили буфер. Активность НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ выражали в ферментативных единицах, где 1 Е = 1 мкмоль/мин (Савченко А.А., Борисов А.Г., 2012). Воспроизводимость метода оценивали путем определения активности каждого фермента не менее чем в пяти параллельных определениях. Ошибка метода не превышала 5%.

Для оценки значимости биолюминесцентного метода определения активности НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ нейтрофилов обследован 51 больной РГП внебольничного и госпитального происхождения, проходивших лечение в отделении гнойной хирургии и отделении реанимации и интенсивной терапии МУЗ «ГБСМП имени Н.С. Карповича» г. Красноярска. В качестве контроля обследованы 112 здоровых людей. У всех обследованных выделяли нейтрофилы и

спомощью биолюминесцентного метода определяли активность ферментов. Все исследования выполнены с информированного согласия испытуемых и в соответствии с этическими нормами Хельсинской декларации (2001 г.).

Известно, что чувствительность биолюминесцентного анализа при работе

сбиологическим материалом снижается (Kudryasheva N.S., 2006). Это связано, во-первых, с ингибирующим влиянием на биолюминесцентную систему продуктов распада клеток и, во-вторых, с различием в рН-оптимума люминесцентной системы бактерий и исследуемых ферментов (рис. 131). Так, для люминесцентного биферментного комплекса НАД(Ф):ФМНоксидоредуктаза-люцифераза оптимум рН составил 7,0, для НАД-ИЦДГ — 7,8, для ЛДГ — 9,0, для МДГ, НАДФМДГ и Г6ФДГ — 9,8.

Для повышения чувствительности метода осуществляется инкубация с коферментом и субстратом соответствующего фермента (для наработки НАДН и НАДФН) с последующим введением в пробу биолюминесцентных реактивов и измерением биолюминесценции. Для каждого фермента были подобраны оптимальные условия (табл. 47). НАД-ИЦДГ является аллостерическим ферментом, активность которого регулируется АДФ и АТФ (Савченко А.А., Борисов А.Г., 2012).

329

https://t.me/medicina_free