Ординатура / Хирургия / Библиотека им академика М.И. Перельмана / Книга_2988_Библиотеки_им_академика_М_И_Перельмана

ДИАГНОСТИКА

Количество продуцируемого НАДФ+ определяют с помощью циклического анализа путем добавления НСТ, глюкозо-6-фосфата и Г6ФДГ. Измеряют поглощение на спектрофотометре при 570 нм. Активность НАД+-киназы рассчитывают путем вычитания количества НАДФ+, продуцируемого в результате реакции, из количества НАДФ+, продуцируемого без добавления лизата. Одна единица НАД+-киназы определяется как количество фермента, продуцирующего 1 мкмоль НАДФ+ за 1 минуту.

Рис. 114. Клеточные эффекты и патофизиологическая роль никотинамида- дениндинуклеотид+-киназы (по Oka S.I. et al., 2023)

Другим ферментом, принимающим участие в обмене НАДФ+/НАДФН, является НАДФН-оксидаза. НАДФН-оксидаза представляет собой ферментативный комплекс, который переносит электрон от НАДФН молекулярному кислороду с образованием супероксид-радикала (О2●–) (Каспаров Э.В. и соавт., 2022). НАДФН-оксидаза, присутствующая в фагоцитирующих клетках, инициирует

300

https://t.me/medicina_free

ДИАГНОСТИКА

респираторный (окислительный) взрыв, генерируя супероксид-радикал. Это вос- палительно-опосредованный процесс, опосредует механизмы завершенного фагоцитоза (Савченко А.А. и соавт., 2013, 2019, 2020). Супероксид-радикал может трансформироваться в перекись водорода (H2O2), что в дальнейшем может дать начало другим активным формам кислорода (АФК), способным регулировать метаболические и физиологические процессы (Савченко А.А. и соавт., 2012, 2014; Серебрякова М.К. и соавт., 2015). Комплекс НАДФН-оксидазы макрофагов был первой идентифицированной системой, которая генерирует АФК не как побочный продукт, а в рамках реализации своей функции (Чучалин А.Г. и соавт., 2023; Bedard K., Krause K.H., 2007). Открытие других членов семейства НАДФНоксидаз пролило свет на участие этих ферментов в широком спектре физиологических и биологических процессов (например, клеточная передача сигналов и экспрессия генов), а также в некоторых патологических состояниях и заболеваниях (Козлов В.А. и соавт., 2021; Waghela B.N. et al., 2021) (рис. 115).

Рис. 115. Вовлеченность никотинамидадениндинуклеотид-оксидазы в различных патофизиологических процессах (по Waghela B.N. et al., 2021)

Измерение активности НАДФН-оксидазы основано на протоколе Someya A. et al. (1997). Принцип анализа заключается в том, что супероксид-ра- дикал, генерируемый НАДФН-оксидазой, окисляет цитохром С, в присутствии СОД супероксид-радикал превращается в перекись водорода, и, таким образом, окисление цитохрома С ингибируется (рис. 116). Активность НАДФН-оксидазы рассчитывают по закону Ламберта–Бера с использованием миллимолярного коэффициента экстинкции окисленного цитохрома С (21 л/ммоль/см).

Тиоредоксинредуктаза (TrxR) является единственным известным ферментом, который катализирует восстановление тиоредоксина с помощью НАДФН и,

301

https://t.me/medicina_free

ДИАГНОСТИКА

Рис. 116. Принцип метода определения активности никотинамидадениндинуклеотидфосфат -оксидазы (по Someya A. et al., 1997)

следовательно, его вклад в поддержание окислительно-восстановительного гомеостаза клеток и тканей имеет первостепенное значение (Тихонова Е.П. и соавт., 20214; Черданцев Д.В. и соавт., 2016; Liu Z., 2023). Данный фермент представляет собой гомодимерный флавопротеин, где каждый мономер содержит простетическую группу ФАД, домен связывания НАДФН и сайт, содержащий редокс-активную дисульфидную связь. TrxR, помимо работы в качестве мощной системы восстановления, связанной с НАДФН, также действует как донор водорода для рибонуклеотидредуктазы — ключевого фермента в синтезе ДНК (Liu Z., 2023). Функциональный комплекс, включающий тиоредоксин, TrxR, НАДФН и отрицательный регулятор, взаимодействующий с тиоредоксином, белок (TXNIP, также известный как белок 1, активируемый витамином D3, кодируемый геном TXNIP), называется тиоредоксиновой системой. Тиоредоксиновая система представляет собой механизм защиты от окислительного повреждения вследствие метаболизма кислорода и реализации окислительно-восстановитель- ных сигналов от перекиси водорода и радикалов азота (Савченко А.А. и соавт., 2014; Liu Z., 2023; Katturajan R. et al., 2022). TXNIP связывается с восстановленным тиоредоксином посредством межмолекулярных дисульфидных взаимодействий и блокирует его активность. TrxR — это селенофермент, обладающий уникальной способностью использовать восстанавливающие эквиваленты НАДФН, генерируемые пентозофосфатным путем, для поддержания тиоредоксина (TRX) в восстановленном состоянии (рис. 117).

Тиоредоксиновая система регулирует несколько процессов, включая экспрессию генов, антиоксидантный ответ, апоптоз и пролиферацию клеток. Например, тиоредоксиновая система модулирует активность таких факторов транскрипции, как NF-kB, REF1 и HIF1α; отдает восстанавливающие эквиваленты на антиоксидантные процессы: пероксиредоксинам и метионинсульфоксидредуктазам; поддерживает биосинтез нуклеотидов с помощью рибонуклеотидредуктазы; регулирует апоптоз, подавляя активность киназы, регулирующей сигнал к апоптозу, тип 1 (ASK1) (Muri J., Kopf M., 2022).

Измерение активности TrxR основано на протоколе Kumar S., Holmgren A. (1999). В присутствии тканевого TrxR происходит окисление НАДФН и

302

https://t.me/medicina_free

ДИАГНОСТИКА

Рис. 117. Компоненты системы TRX и ее клеточные функции

(по Muri J., Kopf M., 2022)

Примечание: (A) Пентозофосфатный путь продуцирует НАДФН, который действует как донор электронов системы TRX. НАДФН поддерживает редуктазу TrxR в восстановленном состоянии. Восстановленный TRX может в конечном итоге отдавать электроны нескольким клеточным белкам. Активность тиоредоксиновой системы регулируется белком, взаимодействующим с TRX (TXNIP), который связывается с TRX и ингибирует его функцию. (B) Клеточные функции восстановленного TRX. Отдавая электроны, TRX поддерживает функциональность клеточных пероксиредоксинов (PRX удаляют перекись водорода), активность рибонуклеотидредуктазы (RNR генерирует 2'-дезоксирибонуклеотиды для синтеза ДНК) и многочисленных факторов транскрипции (TF), регулирующих экспрессию генов. Связываясь с ASK1 и ингибируя ее активность, восстановленный TRX предотвращает апоптоз.

одновременное восстановление инсулина за счет образования тиоловых соединений на его молекуле. Тиоловые соединения конъюгируют с DTNB [реактив Эллмана — 5,5'-дитиобис-(2-нитробензойная кислота)], образуя TNB (тионитробензойная кислота), который имеет максимальное поглощение при 412 нм (рис. 118). Активность TrxR рассчитывается по закону Ламберта–Бера с использованием молярного коэффициента экстинкции TNB (13,6 л/ммоль/см).

303

https://t.me/medicina_free

ДИАГНОСТИКА

Рис. 118. Принцип метода определения активности тиоредоксинредуктазы (по Kumar S., Holmgren A., 1999)

В обзоре Zhou Y. et al. (2022) обобщены важность (в том числе клиническая) и принципы различных (включая и спектрофотометрический) методов детекции лактатдегидрогеназы (ЛДГ), авторы подробно обсуждают преимущества и ограничения представленных методов определения активности ЛДГ. ЛДГ (ЕС 1.1.1.27) является одним из наиболее распространенных ферментов в клетках человека. Фермент структурно характеризуется как сложный тетрамерный белок, который состоит из двух субъединиц — ЛДГ-А и ЛДГ-В, две субъединицы кодируются двумя независимыми генами (Савченко А.А., Борисов А.Г., 2012). Две субъединицы ЛДГ могут формировать в организме человека пять различных форм фермента (изоформ) с образованием гомомеров или гетеротетрамеров, включая ЛДГ-1, ЛДГ-2, ЛДГ-3, ЛДГ-4 и ЛДГ-5. Наиболее важной реакцией, в которой участвует ЛДГ в организме, является превращение молочной кислоты (лактата) и НАД+ в пировиноградную кислоту (пируват) и НАДН соответственно. Стоит отметить, что ЛДГ-A имеет более высокое сродство к пирувату и, соответственно, преимущественно превращает пируват в лактат, окисляя NADH до NAD+. И наоборот, ЛДГ-B имеет более высокое сродство к лактату и, соответственно, преимущественно превращает лактат в пируват, восстанавливая при этом НАД+ до НАДН (Борисов С.А. и соавт., 2021; Валутите Д.Э. и соавт., 2021; Zhou Y. et al., 2022).

Синтезируемый ЛДГ в нормальных клетках (включая клетки иммунной системы) в основном поставляется на внутреннюю мембрану митохондрий, где окисляется пируватдегидрогеназным комплексом до ацетил-КоА, затем ацетилКоА входит в цикл трикарбоновых кислот, где он подвергается окислительному фосфорилированию для обеспечения клетки энергией. В опухолевых клетках изза резко увеличенной интенсивности гликолиза количество лактата возрастает, он не попадает в митохондрии, но при этом выводится из клеток, что определяет значительное повышение концентрации лактата в плазме крови онкологических больных (Борисов А.Г. и соавт., 2016; Савченко А.А., Борисов А.Г., 2012; Савченко А.А. и соавт., 2013).

304

https://t.me/medicina_free

ДИАГНОСТИКА

В сыворотке крови здорового человека активность ЛДГ не превышает 200 ЕД/л. Повышенная активность ЛДГ в крови у онкологических больных связана с выходом фермента из некротических клеток опухоли. Причем активность фермента у данной категории больных может сохраняться и после удаления опухоли в течение 1–2 недель после операции (Comandatore A. et al., 2022). В то же время низкая активность ЛДГ после полного удаления опухоли связана с хорошим прогнозом (Dang C.V., 2012). Таким образом, активность ЛДГ является признанным биомаркером роста опухоли в организме, играет важную роль в качестве прогностического показателя и в ряде случаев определяет тактику медикаментозного лечения онкологических больных. Например, сообщается, что активность ЛДГ в крови является прогностическим биомаркером исхода колоректального рака (Ma Y. et al., 2021), рака легких (Tjokrowidjaja A. et al., 2022), меланомы (Agarwala S.S. et al., 2009), почечноклеточного рака (Zhang N. et al., 2020) и гепатоклеточной карциномы (Cui Z. et al., 2020). Более того, уровень активности ЛДГ является важным клиническим ориентиром при выборе химиотерапии и помогает определить, является ли плевральный выпот доброкачественным или злокачественным (Zhang F. et al., 2017). Кроме того, в исследовании Kelderman S. et al. (2014) показано, что ипилимумаб был менее эффективен, когда уровень ЛДГ в сыворотке превышал норму более чем в два раза, тогда как в работе Diem S. et al. (2016) уровень активности ЛДГ определяется прогностическим фактором для больных меланомой с анти-PD-1-иммунотерапией.

Активность ЛДГ в крови меняется также и при инфекционных заболеваниях. Так, высокая активность ЛДГ в сыворотке обнаружена у больных малярией (de la Serna E. et al., 2021). Установлено, что повышенный уровень ЛДГ связан с риском тяжелого течения COVID-19, соответственно, данный показатель можно использовать в качестве прогноза исхода инфекционного процесса (Lazar Neto F. et al., 2021).

Наиболее важной реакцией, в которой участвует ЛДГ, является превращение лактата и НАД+ в пируват и НАДН. Наиболее распространенным методом спектрофотометрии для определения активности ЛДГ является ультрафиолетовая спектрофотометрия. НАДН имеет один пик поглощения при 260 нм и один при 340 нм, в то время как НАД имеет только один пик поглощения при 260 нм. Это важное свойство отличает их друг от друга, а также является физической основой для измерения скорости метаболизма во многих метаболических тестах (Zhou Y. et al., 2022). Разработан простой спектроскопический анализ для обнаружения ЛДГ в слюне, где анализ основан на взаимном превращении каталитического пирувата и лактата в присутствии ЛДГ, а снижение поглощения при 340 нм, вызванное НАДН, пропорционально активности ЛДГ в слюне (de la Serna E. et al., 2021). Кроме того, в работе Lee W.S. et al. (2020) сообщается об иммуноанализе на основе микрофлюидных микропланшетов, который требует лишь

305

https://t.me/medicina_free

ДИАГНОСТИКА

небольшого количества антител для более быстрого обнаружения ЛДГ по сравнению с традиционным ИФА. Весь корпус этого микропланшета состоит из 96-луночного планшета, который имеет входное отверстие для пипеточной инъекции, выходное отверстие, открытое в сторону впитывающей прокладки, и микрожидкостный канал между ними. Микрофлюидный микропланшет представляет собой спиральный микрофлюидный канал с в 1,5 раза большей площадью поверхности и в 50 раз большим отношением площади поверхности к объему по сравнению с обычными планшетами для ИФА (рис. 119). Предел обнаружения составляет всего 6,25×10–3 Ед/л (Lee W.S. et al., 2020).

Рис. 119. Схема определения активности лактатдегидрогеназы с использованием микрофлюидного микропланшета (по Lee W.S. et al., 2020)

Примечание: a — оптическое изображение микрофлюидного микропланшета. Микрофлюидный микропланшет позволяет проводить небольшой объем и быстрый иммуноанализ благодаря микрофлюидному каналу; b — последовательность ИФА-процессов для определения активности лактатдегидрогеназы; c — сравнение метода определения активности лактатдегидрогеназыс использованием обычного ИФА и микрофлюидного микропланшета

306

https://t.me/medicina_free

ДИАГНОСТИКА

Также разработан колориметрический способ определения активности ЛДГ. Колориметр — это лабораторный прибор, который по изменению цвета исследуемой пробы определяет концентрацию вещества или активность фермента. Подобные приборы широко используются для рутинного измерения из-за таких преимуществ, как доступность, портативность и прямое визуальное наблюдение за результатами анализа (Zhou Y. et al., 2022). На рис. 120. представлен разработанный Kannan B. et al. (2015) высокостабильный и массовый колориметрический биосенсор для определения активности ЛДГ, одно измерение на котором длится менее чем 5 минут и имеет предел обнаружения всего 13 ЕД/л. В основу датчика был положен принцип фиксации пуллулана (полисахаридный полимер, состоящий из мальтотриозных единиц, также известный как α-1,4-;α-1,6-глюкан) на бумаге. Для проведения анализа на бумагу, зафиксированную пуллуланом, добавляют образец, содержащий ЛДГ. Изменение цвета после добавления исследуемого образца можно увидеть невооруженным глазом, активность фермента оценивается с помощью цифровой камеры и программного обеспечения для обработки изображений (Kannan B. et al., 2015). Датчик можно напечатать на бумажных носителях с помощью автоматизированной системы печати, что позволяет производить датчики в соответствии с высокоскоростным автоматизированным производством. Сенсор использует очень малый объем реагентов, что значительно снижает затраты, связанные с анализом. Это снимает необходимость в сложном лабораторном оборудовании, дорогостоящей транспортировке и хранении реагентов, а также в сложном обращении с образцами. Датчик можно использовать для быстрого и недорогого скрининга большого количества образцов.

Arias-Alpízar K. et al. (2022) сообщили об аналогичном датчике, который основан на одноэтапном магнитном иммуноанализе и может быть выполнен менее чем за 20 мин на недорогом и простом одноразовом устройстве на бумажной основе. Тест состоит из однократной инкубации образца лизированных клеток со смесью реагентов в течение 5 мин. Затем смесь пипеткой переносится непосредственно на датчик. Предел обнаружения 0,39 ЕД/л может быть достигнут с помощью визуальной колориметрии (AriasAlpízar K. et al., 2022). Кроме того, Papaneophytou C. et al. (2021) показали, что активность ЛДГ можно определять по взаимодействию НАДН с НСТ и феназинметилсульфатом, что приводит к изменению цвета смеси с последующим образованием сине-фиолетовых гранул.

Halvorsen C.P. et al. (2019) сообщили о прототипе изготовленного вручную быстрого бумажного теста, который требовал небольшого количества биологического образца и использовал камеру смартфона для обеспечения колориметрических измерений активности ЛДГ менее чем за 4 мин. При анализе образца цельной крови устройство включало разделение цельной крови на плазму на наборе фильтровальной бумаги, колориметрическую мембрану с использованием сухой химической реакции на фильтрующей мембране и анализ активности фермента с помощью программного обеспечения на смартфоне (Halvorsen C.P. et al., 2019).

307

https://t.me/medicina_free

ДИАГНОСТИКА

Рис. 120. Колориметрический биосенсор на бумажном носителе для определения активности лактатдегидрогеназы: A — подготовка датчиков

лактатдегидрогеназы на бумажной основе. B — анализ активности лактатдегидрогеназы в сыворотке крови (по Zhou Y. et al., 2022)

Разработан флуориметрический метод определения активности ЛДГ (Zhou Y. et al., 2022). Известно, что при облучении флуоресцентного вещества падающим светом с определенной длиной волны (обычно в диапазоне ультрафиолетового света) вещество поглощает световую энергию, переходит в возбужденное состояние с последующим испусканием квантов света с большей длиной волны, чем длина волны падающего света (обычно уже в видимом диапазоне). По сравнению с предыдущими методами детекции флуоресцентный анализ имеет преимущества высокой чувствительности, высокой пропускной способности, широкого

308

https://t.me/medicina_free

ДИАГНОСТИКА

диапазона линейности, что делает его хорошим выбором для детекции активности ЛДГ.

В 2010 году Ren X. et al. (2010) сообщили об обнаружении активности ЛДГ на основе квантовых точек CdTe/CdS. Как показано на рис. 121, при данном подходе флуоресценция QD сначала гасится НАД+, вызванным хемосорбцией или электростатической диффузией НАД+ на поверхность QD, что влияет на их химические связи. Затем флуоресценция постепенно восстанавливалась при добавлении ЛДГ, что связывали с восстановлением НАД+ до НАДН в реакции, катализируемой ЛДГ, расходуя таким образом НАД+ и ослабляя ингибирующее действие НАД+ на флуоресценцию QD. Предел обнаружения этого метода составил 75 ЕД/л, он имеет хорошую линейность в диапазоне 150–1500 ЕД/л с коэффициентом корреляции 0,996 (Ren X. et al., 2010).

Рис. 121. Схема флуоресцентного метода определения активности лактатдегидрогеназы (по Ren X. et al., 2010): а) при отсутствии окисленной и восстановленной формы никотинамидадениндинуклеотида и лактатдегидрогеназы; b) в присутствии окисленной и восстановленной формы никотинамидадениндинуклеотида и отсутствии лактатдегидрогеназы; с) при добавлении окисленной и восстановленной формы никотинамидадениндинуклеотида и лактатдегидрогеназы

309

https://t.me/medicina_free