Добавил:
Ivansavin314
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Патофизиология опухолевого роста Роль наследственности в патологии.pdf
51
бедра
ОБ – однояйцевые близнецы, РБ – разнояйцевые близнецы.
Методы диагностики наследственных заболеваний
Цитологический метод - исследование кариотипа в ядрах делящихся
клеток. Кариотип определяют либо в делящихся клетках красного костного
мозга, либо искусственно культивируют любые доступные клетки (например,
лимфоциты, эпителиоциты плода из амниотической жидкости). К культуре
клеток добавляют митоген (фитогемагглютинин) и через 2-3 суток
останавливают процесс их деления с помощью колхицина. Далее клетки
обрабатываются гипотоническим расвором натрия хлорида, в результате
цитолемма разрывается и получается «россыпь хромосом». В стадию метафазы
хромосомы максимально спирализованы и хорошо видны под микроскопом. Их
подсчитывают и идентифицируют. Таким образом можно диагностировать
геномные и грубые хромосомные мутации.
Для выявления количественных изменений половых хромосом
определяют половой хроматин (тельца Барра, Х-хроматин). Он представляет
собой гетерохроматизированную, инактивированную Х-хромосому, которая
видна как глыбка треугольной или округлой формы на периферии ядра. У
женщин такие тельца в норме видны в 20-60% клеток (это определяется фазой
клеточного цикла и функциональной активностью данной клетки), у мужчин их
быть не должно, но до 13% клеток могут содержать т.н. псевдохроматин –
конденсированные участки аутосом и Y-хромосомы. Половой хроматин можно
обнаружить в эпителии слизистой оболочки рта, влагалища, ядрах эпителия
канальцев почек. Для более точной диагностики пола используется
определение Y-хроматина. С этой целью клетки окрашивают флюорохромами,
и конденсированный участок Y-хромосомы при микроскопии в
ультрафиолетовых лучах виден как светящаяся глыбка.
Отсутствие полового хроматина у женщин указывает на моносомию
(ХО). Наличие полового хроматина по женскому типу у мужчин, два и более
52
тельца у мужчин и женщин свидетельствуют о наличии полисомии Х (ХХХ,
ХХY, ХХХY). В ядрах лейкоцитов половой хроматин обнаруживается в виде
барабанных палочек.
Деpматоглифика - установление диагноза по линиям ладоней, пальцев и
подошв. Hаибольшее значение имеет этот метод при изучении хромосомных
заболеваний. Довольно характерными изменениями кожного узора
сопровождается трисомия 13, 18, 21 пар. Hапример, при болезни Дауна
отмечается одна поперечная складка на пятом пальце, поперечная линия на
ладони ("обезьянья линия") и др. Hадо отметить, что дерматоглифика может
служить только вспомогательным диагностическим тестом, так как аномальные
признаки могут встречаться и у здоровых людей.
Биохимический метод часто используется при диагностике генных
болезней. Биохимические показатели (первичный белковый продукт гена,
накопление патологических метаболитов внутри клетки) отражают сущность
болезни более адекватно, чем клинические симптомы. С помощью
биохимических методов описано более 1000 наследственных болезней обмена
веществ. Дефекты ферментов устанавливают путем определения содержания в
биологических средах (например, моче и крови) продуктов метаболизма,
являющихся продуктом функционирования данного белка. Например, с
помощью тонкослойной хроматографии мочи и крови можно диагностировать
нарушения обмена аминокислот, олигосахаридов и гликозаминогликанов
(мукополисахаридов). Газовая хроматография применяется для выявления
наследственных болезней обмена органических кислот. С помощью
электрофореза гемоглобинов диагностируется вся группа гемоглобинопатий.
Но решающим методом, особенно при установлении генной патологии,
является молекулярно-генетический метод. Это группа методик для
исследования структуры ДНК (блот-гибридизация с использованием ДНКзондов, ПЦР-амплификация отдельных фрагментов, аллель-специфическая
гибридизация, секвенирование гена или его фрагмента), что позволяет
диагностировать заболевание на уровне первичного патологического гена уже в
53
первом триместре беременности. В некоторых случаях такая пренатальная
диагностика позволяет провести дородовую профилактику и лечение
заболевания.
Сущность ДНК-зондовой диагностики (рис.4):
сначала ДНК, выделенная из любой ткани, подвергается расщеплению
ферментами-рестриктазами, которые «узнают» строго определенную
последовательность нуклеотидов, причем набор фрагментов для каждого
индивида всегда постоянен. Данный этап необходим, т.к. ДНКдиагностика весьма дорого стоит, а количество генов во всех хромосомах
велико. Поэтому при подозрении на генетическое заболевание из
хромосом выделяется тот участок ДНК, который содержит
предполагаемый дефектный ген.
далее осуществляется полимеразная цепная реакция (ПЦР), с помощью
которой в течение нескольких часов этот фрагмент ДНК размножается в
54
количестве, превышающем исходное в 109 раз. Это облегчает работу с
минимальными количествами образцов ДНК. ПЦР настолько
чувствительна, что позволяет исследовать единичную копию гена в
исходном материале.
смесь фрагментов подвергают электрофорезу и они разделяются по
размеру. Местоположение определенных участков всегда постоянно.
зафиксированные на фильтре фрагменты подвергаются гибридизации с
т.н. зондом – олигонуклеотидом, меченным радиоактивным изотопом.
Зонд – это клонированный генно-инженерным методом конкретный ген,
функция которого известна. Он связывается с соответствующим ему
геном по принципу комплементарности.
не связавшиеся с фильтром радиоактивные метки отмывают и делают
рентгеновский отпечаток. Изменение положения, исчезновение или
появление нового фрагмента свидетельствует о перестройке нуклеотидов
в соответствующем гене.
Одновременно используются и другие методы исследования,
применяемые в клинической практике: рентгенологический,
электрокардиографический, электроэнцефалографический и т.д
Профилактика наследственных болезней
Можно выделить три вида профилактики наследственной патологии:
Первичная профилактика – действия, которые должны предупредить
зачатие больного ребенка. Это можно реализовать через планирование
деторождения и улучшение среды обитания человека. Планирование
деторождения включает в себя:
Оптимальный репродуктивный возраст – 21-35 лет.
Отказ от деторождения в случаях высокого риска наследственной и
врожденной патологии (при отсутствии надежных методов дородовой
диагностики, лечения и реабилитации больных)
55
Отказ от деторождения в браках с кровными родственниками и между
двумя гетерозиготными носителями патологического гена
Улучшение среды обитания человека должно быть направлено на
предупреждение вновь возникающих мутаций. В данную программу входят:
1. Прекращение наземных ядерных испытаний.
2. Обоснованность и ограничение рентгенологических процедур
(усовершенствование и обеспечение максимальной защиты при применении
медицинских методик).
3. Разработка технологий экологически чистой энергии.
4. Проверка на мутагенность и тератогенность (в частности, лекарственных
препаратов, новых химических веществ).
В последнее время с профилактической целью стали использовать
воздействие антимутагенных факторов.
Вторичная профилактика – осуществляется путем прерывания
беременности в случае высокой вероятности заболевания плода или
пренатально диагностированной болезни.
Показания для пренатальной диагностики:
наличие в семье наследственного заболевания;
возраст матери старше 37 лет;
носительство матерью гена Х-сцепленного рецессивного заболевания;
наличие в прошлом спонтанных абортов в ранние сроки беременности,
мертворождений, детей с пороками развития, хромосомной патологией;
гетерозиготность обоих родителей по одной паре аллелей при патологии с
аутосомно-рецессивным типом наследования;
зона повышенного радиационного фона
На данный момент существует целый ряд методик для обнаружения
дефектов в пренатальный период. Эти методы позволяют диагностировать все
формы хромосомной патологии, ошибки метаболизма.
1. Взятие пробы эпителия хориона (между 8-10 неделями)
2. Амниоцентез (пункция околоплодного пузыря на 17-18 неделе)
56
3. Кордоцентез (получение пуповинной крови плода на 20-22 неделе).
Клетки, полученные этими тремя методами, используются для
цитогенетического и молекулярно-генетического исследований.
4. Ультразвуковая эхография. На 16 - 20-й неделе беременности уже
возможна диагностика отсутствия головного или спинного мозга,
дефектов костной системы, закрытия невральной трубки, заращение
естественных каналов желудочно-кишечного тракта, пороки сердца.
5. ЯМР-томография плода позволяет выявить структурные аномалии, не
обнаруживаемые при УЗИ, например, малые аномалии мозга, туберозный
склероз, аномалии структуры почек и др.
6. Определение α-фетопротеина в крови матери или амниотической
жидкости плода (повышение α-фетопротеина обнаружено при
анэнцефалии, спинномозговой грыже, омфалоцеле и др. пороках и
снижение его при синдроме Дауна).
7. Биопсия печени, кожи плода (с целью выявления таких заболеваний, как
ихтиоз, буллезный эпидермолиз и др.)
Прерывание можно делать только в установленные сроки и с согласия
женщины. Основанием для элиминации эмбриона или плода является
наследственная болезнь. Это не самое лучшее, но в настоящее время
единственно пригодное решение при большинстве тяжелых и смертельных
генетических дефектов.
Третичная профилактика – коррекция проявления патологических
генотипов. Применяется и при наследственных болезнях, но особенно часто и
эффективно – при болезнях с наследственной предрасположенностью. С ее
помощью можно добиться полной нормализации либо уменьшения
выраженности патологического процесса. Третичная профилактика включает в
себя комплекс лечебных мероприятий, которые можно осуществлять
внутриутробно (например, при резус-конфликте) или после рождения
(типичный пример – фенилкетонурия). Также сюда относится профотбор
57
(например, носителям гена дефектной глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы
противопоказаны контакты со свинцом, пестицидами и др. окислителями).
Принципы лечения наследственных болезней
Заместительная терапия. К этим методам относится замена
патологического или отсутствующего продукта гена. Классический пример заместительная терапия при сахарном диабете - введение инсулина. При
наследственных дефектах синтеза тиреоидных гормонов вводят препараты
йода, аномалиях стероидного обмена - глюкокортикоиды. При наследственных
иммунодефицитных состояниях (дисгаммаглобулинемиях) - введение
глобулина и полиглобулина. При гемофилии А - переливание донорской крови
и введение антигемофильного глобулина.
Разновидность заместительной терапии - витаминотерапия. Вводятся
дозы, в десятки и сотни раз больше" нормальных, "физиологических. Так,
избыточные дозы витамина В1 дают хороший эффект при заболевании "моча с
запахом кленового сиропа". Ксантинурия, гомоцистинурия, судорожный
синдром относятся к витамин-В6-зависимым состояниям. При некоторых
наследственных заболеваниях хорошие результаты при введении витамина
В12(три формы метилмалоновой ацидемии), витамина А (фолликулярный
кератоз - болезнь Дарье), фолиевой кислоты (мегалобластная анемия в
сочетании со слабоумием), витамина Е (акантоцитоз).
Используют методы индукции и ингибиции продуктов метаболизма и
ферментов. Так, при синдроме Криглера-Найяра (генетическая недостаточность
глюкуронилтрансферазы) улучшается состояние больных при индукции
глюкуронилтрансферазы фенобарбиталом. При болезни Вильсона-Коновалова
(гепатолентикулярная дегенерация) с целью усиления выделения
церулоплазмина используют эстрогенные гормоны или ингибицию обмена
меди путем ее связывания с лекарственными препаратами (унитиол,
пеницилламин). Хорошие результаты при лечении подагры подавлением
синтеза мочевой кислоты аллпуринолом, тиопуринолом. С помощью
58
ингибиции обмена и выведения аномальных продуктов обмена излечивается
гемохроматоз путем введения десферриоксамина, образующего комплекс с
железом.
При некоторых заболеваниях успешным, а иногда и единственным
методом лечения является диетотерапия. Этот метод требует соблюдения
определенных условий: точный ранний диагноз, максимальная адаптация
диеты к требованиям растущего организма и тщательный контроль за его
проведением. При фенилкетонурии устранение из пищевого рациона
продуктов, содержащих фенилаланин (его содержание не должно превышать
21% возрастной физиологической нормы). При болезнях нарушения цикла
мочевины ограничение белка. Галактоземия корригируется пищей, не
содержащей галактозу. Ограничивают прием углеводов при гликогенозе Кори
(дефект глюкозо-6-фосфатазы).
Широко применяются хирургические методы для лечения
наследственных дефектов. С их помощью исправляют такие пороки, как заячья
губа и волчья пасть, полидактилию, синдактилию, врожденные аномалии
сердца и сосудов. Используют пересадку почки при наследственном кистозном
поражении. При сфероцитозе хорошие результаты дает экстирпация селезенки.
При наследственных иммунодефицитах делается пересадка
иммунокомпетентных органов.
На современном этапе разрабатываются методы генной инженерии, за
которыми большое будущее и с помощью которых можно повлиять на
наследуемые признаки на всех уровнях действия гена.
Генная инженерия и генотерапия - внесение в клетки чуждой
генетической информации в виде участка ДНК, способного к транскрипции в
клетке реципиента. Цели генной терапии в настоящее время - устранение
генетических дефектов в соматических клетках. Коррекция наследственной
информации в зародышевых клетках или на самых ранних стадиях развития
зиготы в настоящее время невозможна.
59
Перенос генов осуществляется с помощью вирусов (РНК-ретровирусов и
ДНК-вирусов), фосфата Са2+, микроинъекций и методом слияния (слияние
клеток с нагруженными ДНК липосомами).
Генная инженерия и генная терапия используются пока весьма
ограниченно, большинство разработок находятся на стадии эксперимента.
Широкое применение в настоящее время получила методика получения
человеческих гормонов с помощью генно-модифицированных бактерий E.coli.
Например, инсулин таким образом получают с 1979 г., а гормон роста –
соматотропин – с 1980.
Также предпринимались попытки коррекции генотипа соматических
клеток. Впервые реальная генная терапия была произведена пациентке с
недостаточностью аденозиндезаминазы в 1990 г. Дефицит данного фермента
сопровождается развитием тяжелого иммунодефицита. Из крови больной были
выделены лимфоциты, в которые с помощью ретровируса внедрили ген
аденозиндезаминазы и трансдуцированнные лимфоциты ввели обратно. Эту
процедуру повторяли 7 раз в течение 10 месяцев. За это время 25% лимфоцитов
заменились на генно-инженерные. Еще через полгода врачи констатировали
полное исчезновение клинических проявлений иммунодефицита.
Еще в качестве примера можно привести экспериментальное лечение
гиперхолестеринемии, обусловленной дефектом рецептора ЛПНП
(липопротеидов низкой плотности) в печени. При данном заболевании в крови
накапливаются атерогенные липопротеиды, наблюдается выраженный
атеросклероз, рано развиваются инфаркты и инсульты. Больному удалили
сегмент печени, и в полученные таким образом гепатоциты внедрили ДНК
нормального рецептора. Рекомбинантные клетки печени ввели в воротную
вену. Через некоторое время было отмечено уменьшение содержания в крови
ЛПНП.
Клинические испытания проходит генная терапия остеосаркомы и
меланомы. В первом случае в клетки опухоли ввели ген белка р53,
останавливающий деление клеток, во втором – ген белка гистосовместимости I
60
класса, что улучшает распознавание клеток опухоли иммунной системой. В
результате выживаемость пациентов с остеосаркомой увеличилась в два раза, а
31% пациентов с меланомой не имели рецидива опухоли в течение 6 лет.
Но, несмотря на очевидный успех попыток генотерапии, нельзя не видеть
и ее недостатки. Во-первых, для коррекции были использованы уже зрелые
клетки, неспособные к делению, поэтому для стойкой ремиссии необходимо
регулярное введение рекомбинантных клеток. Во-вторых, размеры некоторых
генов слишком велики, чтобы их можно было встроить в вирусный геном (в
частности, ген VIII фактора свертывания, недостаток которого приводит к
гемофилии А). Остальные способы внедрения генов в клетки (микроинъекции,
липосомы) еще недостаточно апробированы даже в эксперименте – ведь вирус
обеспечивает адресную доставку гена в ДНК, а встроится в ДНК ген,
доставленный с липосомой, или нет – неизвестно. Но, с другой стороны,
использование вирусов для доставки ДНК в клетки тоже небезопасно – они не
теряют при этом своей вирулентности полностью, более того, предсказать
реакцию макроорганизма на видоизмененный вирусный геном тоже
невозможно. 17 сентября 1999 г. в клинике Университета Пенсильвании умер
17 летний Джесси Гелзингер, которого пытались вылечить путем генной
терапии от наследственного дефицита орнитинкарбамоилтрансферазы – одного
из ферментов печени, участвующего в обезвреживании аммиака. Смерть
наступила вследствие острой полиорганной недостаточности, механизм
развития которой пока окончательно неясен. Этот случай стал тревожным
сигналом для многих медицинских центров, начинающих генную терапию, т.к.
в 30% случаях для доставки генов используются аденовирусные вектора.
Таким образом, можно сделать заключение, что генная терапия пригодна
для лечения широкого спектра заболеваний, но эффективность ее на
сегодняшний день близка к нулю. Еще неизвестно, сможет ли генная терапия в
будущем обеспечить полноценную генокоррекцию, которая не представит
угрозы для потомства и в какой мере полезность и необходимость