Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Элиситоры и их применение в растениеводстве
.pdf
Заметим также, что для передачи сигнала опасности важную
роль играют такие фитогормоны, как SA, JA и EТ. SA принимает
участие в биосинтезе различных PR-белков, фенольных соединений и в возникновении SAR. JA выполняет свои функции
в процессе трансдукции сигнала при заражении некротрофными паразитами или атаках насекомых. JA и МеJA индуцируют образование ингибиторов протеиназ (PI), защищающих растения от патогенов и насекомых. Похожим действием обладает
и EТ.
2.2.2 Распознавание элиситоров в случае ETI
Активации иммунитета PTI через PAMPs и PRRs, в общем,
может оказаться достаточно для приостановки роста патогена.
Однако в случае патогенов, адаптированных к PTI, для избежания инфицирования растения PTI может и не хватить. Действительно, как уже говорилось выше, адаптированные патогены развили такие стратегии инфицирования растений, что за счет избежания распознавания своих PAMPs или активного подавления
защитных PTI-откликов, а также подавления отдельных стадий
защитного сигналинга они приобрели способность несмотря на
PTI все же вызывать болезни растений. Чтобы обойти распознавание и обмануть PTI патогены могут, например, скрыть или изменить свой РАМР [346]. Так, Agrobacterium tumefaciens имеют
модифицированный флагеллиновый домен, который достаточно
долго не распознается флагеллиновым рецептором арабидопсиса
[347]. Кроме того, патогены могут подавлять базальные защитные PTI-отклики, используя специфические эффекторные молекулы [346], как например, супрессия PTI-защиты в арабидопсисе
эффекторными белками AvrRpm1 и AvrRpt2 Pseudomonas syrin-
gae [348].
Вообще, адаптированные грамотрицательные бактериальные
патогены развили способность противодействовать PTI путем
выделения с помощью системы TTSS бактерии [274] различных
эффекторных белков и доставки их прямо внутрь клетки растения [349]. Заметим, что наборы эффекторов даже очень близких
71
штаммов бактерий имеют различия. Число таких эффекторных
белков типа III (TTEs, type III effectors) обычно составляет несколько десятков и они имеют структуры, обеспечивающие их
прохождение через мембраны [350, 351]. Поэтому их рецепторы,
в отличие от рецепторов неспецифических элиситоров PAMPs,
находятся, как правило, не в мембране, а в цитоплазме и даже
в ядре.
Следует сказать, что многие патогены для подавления PTI
растения вырабатывают также токсины (например, коронатин
(coronatine)) или внеклеточные полисахариды (EPS, extracellular
polysaccharides), которые, как и белковые эффекторы, способны
препятствовать PTI. К подавлению PTI-откликов и, соответственно, развитию инфекции может привести ингибирование или
разрушение рецепторов [264, 268]. Наконец, некоторые эффекто-
ры способны манипулировать отдельными сигнальными процессами, но только для немногих из них были идентифицированы мишени в растении, на которые эти эффекторы направлены
[352, 353].
Пути преодоления PTI в основном известны для бактериальных патогенов. Гораздо меньше информации об используемых
патогенами путях преодоления PTI имеется в отношении грибов
и оомицетов, которые, как оказалось, также могут использовать
подобную бактериям стратегию [349]. Например, грибы могут
выделять низкомолекулярные глюканы, затрудняющие связывание с рецепторами растений грибных элиситоров [354].
Механизмы ETI-распознавания. Патогены, манипулируя
клеточными механизмами растения для избежания PTI-откликов, могут запустить активацию иммунитета ETI [264, 268, 295].
Действительно, в растениях в ходе коэволюции появились так
называемые гены устойчивости (R-гены), которые кодируют
R-белки, способные распознавать эффекторы патогена и индуцировать ETI-иммунитет против адаптированных патогенов.
Заметим также, что большинство R-белков не являются трансмембранными, а находятся в цитоплазме. При этом некоторые
из них могут быть локализованы даже в ядре. Таким образом,
ETI основывается на присутствии в клетке растения таких специ-
72
фических ключевых составляющих иммунитета ETI, как R-белки,
защищающие растения от адаптированных к PTI патогенов.
R-белки осуществляют распознавание подавляющих защиту растения эффекторов путем специфического прямого или непрямого взаимодействия с ними [16, 296], а иногда обоими способами
одновременно [355]. Поэтому, R-белки растения в некоторых
случаях напрямую взаимодействуют с эффекторными белками
[321, 349], а в других случаях могут отслеживать изменения или
целостность компонент своей иммунной системы PTI [297, 356],
при этом возмущения или разрушения этих компонент эффекторами могут запустить активацию R-белков (непрямое взаимодействие).
Заметим, что ранее предполагалось [357], что устойчивость
«ген на ген» (ETI) осуществляется с помощью прямого взаимодействия между R-белками и эффекторами (Avr-белками), кодируемыми соответствующими генами. Однако прямое взаимодействие между ними было зафиксировано только в нескольких
случаях [358], а непрямое взаимодействие происходит чаще всего с помощью промежуточных белков (мишени эффекторов), названных «стражниками» («Guardee» [183]). R-бел к и отслеживают
этих «стражников» на предмет их модификаций, вызванных эффектором, и распознают эти изменения или потерю «стражников»
как сигнал для индуцирования ETI [268]. Часто такое непрямое
взаимодействие называют «guard»-гипотезой или «сторожевой»
моделью Бизена-Джонса [333, 357]. Согласно этой гипотезе в обычном состоянии эффекторные элиситоры выполняют супрессорные функции и рассматриваются как вирулентные факторы, мишенями которых могут быть участвующие в обычном метаболизме белки или R-белки. Но R-белок способен связываться
с комплексом эффектор – мишень и индуцировать защитные реакции. Таким образом, отдельные молекулы патогена, которые
часто называются авирулентными факторами, на самом деле
в обычном состоянии являются вирулентными факторами, поэтому в настоящее время вместо терминов «авирулентные и вирулентные факторы» чаще используют термин «эффекторы» [16, 292].
73
Прямое либо непрямое распознавание R-белками эффекторов патогена обычно ведет к сильной и более продолжительной
защитной реакции – реакции сверхчувствительности [268, 294],
характеризующейся быстрой клеточной смертью в месте инфицирования и локальным некрозом. Заметим, что распознавание
РAMPs или DAMPs (PTI-иммунитет) обычно не приводит к клеточной смерти, хотя отдельные РAMPs все же индуцируют сверхчувствительный отклик [281], тогда как некоторые R-гены обходятся без индуцирования реакции СЧ [282].
Эффекторы. Вовлеченные в преодоление РTI секретируемые патогеном молекулы назвали «эффекторами». Они функционируют как во внеклеточном пространстве растения (апопласт),
так и внутри клеток и обычно представляют собой белки и малые молекулы патогенов, которые изменяют структуру и функцию клетки хозяина. Эти изменения могут облегчать инфицирование (вирулентные факторы) или запускать защитные отклики
(авирулентные факторы), а также могут происходить и те, и другие изменения. Одни эффекторы могут распознаваться во внеклеточном пространстве, тогда как другие переносятся через клеточную мембрану в цитоплазму растения и распознаются цитоплазмическими R-белками.
Эффекторы кодируются соответствующими генами. Считается, что патогены, содержащие Avr-гены, авирулентны для растения, несущего соответствующие R-гены, тогда как для растений,
не несущих подходящие R-гены, патогены вирулентны [268, 295,
321]. При этом следует заметить, что авирулентные гены имеются не только в фитопатогенах. Так, Avr-гены были идентифицированы в непатогенах, в частности в некоторых видах Rhizobium
[359]. В целом эффекторы выполняют не только функции Avrбелков, т. е. участвуют в защите растений, но и могут осуществлять другие функции и в норме представляют собой, как уже
говорилось выше, вирулентные факторы [268].
Наиболее изученными оказались бактериальные эффекторы
[16], в частности, AvrPto и AvrPtoB, негомологичные по последовательностям эффекторы Pseudomonas syringae DC3000, распознаваемые в томатах R-геном PTO, прерывают защитный сигна-
74
линг общего элиситора g22 на раннем этапе MAPK-каскада [360].
Интересно, что оба эффектора ингибируют индуцированное
g22 взаимодействие FLS2-BAK1 и, таким образом, можно сказать, что они нацелены на ВАК1, как интегрирующего корецептора, а не на другие PRRs. AvrPto и AvrPtoB ингибируют также
независимый от ВАК1 защитный сигналинг [339], который индуцируется путем обработки растения таким элиситором, как
хитин. Кроме того, в качестве эффектора следует отметить Hop
AI1 – консервативный эффекторный белок Pseudomonas syringae,
ингибирующий индуцируемое g22 накопление каллозы в арабидопсисе [361]. Сюда же относятся синтезируемые патогенами
низкомолекулярные токсины, нацеленные против защитного отклика растения. Например, Pseudomonas syringae DC3000 продуцирует коронатин – соединение, имитирующее жасмонат
и противодействующее индуцируемому РAMPs восстановлению отверстий устьиц на листьях [362]. Наконец, многие фитопатогенные бактерии при колонизации межклеточного пространства растения синтезируют в качестве эффекторов внеклеточные полисахариды, которые, например, в листьях арабидопсиса
ингибируют индуцируемый РAMPs приток Ca2+ в цитозоль и такие защитные отклики, как окислительный взрыв [363].
По сравнению с эффекторами бактериальных фитопатогенов, значительно меньше известно о фунгальных эффекторах
[321]. Так, из гриба Cladosporium fulvum были клонированы Avrгены, кодирующие в томатах малые богатые цистеином внеклеточные белки [364], один из которых (Avr2) является протеиназным ингибитором (PI), а второй (Avr4) связывается с хитином,
представленным в фунгальных клеточных стенках, тем самым
предохраняя их от деградации растительными хитиназами.
Заметим, что различают эффекторы, напрямую модифицирующие белки растений за счет их протеолиза, эффекторы, изменяющие транскрипционные процессы в растении, и эффекторы, которые воздействуют на гормональный сигналинг. В связи
с увеличивающимся числом распознанных эффекторов стали
предприниматься усилия для их классификации [264, 268, 352].
Следует также сказать, что понимание того, как эффекторы функ-
75
ционируют по отдельности, не дает представления о сложности
их коллективного функционирования. К тому же одни эффекторы
могут специфически изменять активность других эффекторов,
т. е. в реальности существуют значительные перекрывания между
различными защитными сигналингами. Таким образом, чтобы
понять, почему фитопатоген вызывает или не вызывает болезнь
у отдельного растения, требуется понимание не только как его
эффекторы индивидуально функционируют, но и как они функционируют совместно.
R-белки: локализация, структура, классификация, фун-
кции. За последние два десятилетия были клонированы многие
R-гены различных видов растений, причем в основном пасленовых [321, 353]. Они проводят распознавание различных эффекто-
ров из всех классов фитопатогенов [2] и придают растениям
специфическую устойчивость [293, 365]. Надо сказать, что про-
дукты экспрессии большинства клонированных R-генов идентифицированы. Как правило, это R-белки, принадлежащие семейству LRR-белков (NB-LRR-белки [323]). Заметим, что R-гены
являются наиболее изменчивыми генами растений, но при этом
R-белки далеких друг от друга видов растений могут оказаться
гомологичными [295].
R-белки в основном локализуются внутри клеток [293, 297,
321] . Однако некоторые из них могут находиться в мембране
и иметь трансмембранный домен, который обеспечивает прохождение сигнала опасности через мембрану. У отдельных R-белков (табак, ячмень, картофель) LLR-область может быть связана
с фактором регуляции транскрипции WRKY, поэтому они способны локализоваться в ядре. Таким образом, R-белки для выполнения своих функций наряду с цитоплазмической локализацией могут находиться и в самом ядре.
Начиная с 90-х годов XX века структуру R-белков стали постепенно расшифровывать. В настоящее время структура, классификация и функции различных R-белков обсуждаются во многих работах (см., например, [273, 293, 297, 321, 353]). Так, сейчас
известно, что NB-LRR-белки, к семейству которых чаще всего
принадлежат R-белки [16], имеют модульные доменные струк-
76
туры. Подавляющее большинство R-белков включают в себя вариабельный N-конец, центральный нуклеотид-связывающий NB
(nucleotide-binding)-участок, являющийся частью более крупно-
го домена NB-ARC, а также самый крупный LRR-домен с богатыми лейцином повторами аминокислотных последовательностей на С-конце [273, 293, 323, 353]. Поэтому эта группа R-белков
коллективно названа NB-LRR-белками. На N-конце могут присутствовать также СС- или TIR-домены.
Хотя R-гены придают устойчивость различным патогенам,
кодируемые ими R-белки имеют общий набор консервативных
фрагментов, на основе которых R-белки классифицируются [321].
Так, в зависимости от их N-концевых областей N B -LRR-бел к и
растений могут делиться на TNL- и CNL-белки [297]. Действительно, если на N-конце присутствует рецепторный домен, гомологичный человеческому Toll-Interleukin-1 [4], то этот домен
называют TIR-доменом [323, 353], а NB-LRR-белки – TIR-NBLRR или TNL-белками. Если NB-LRR-белки на N-концах имеют
скрученные структуры СС (coiled-coil, скрученная спираль), то
их называют CC-NB-LRR или CNL-белками [323]. Кроме того,
в зависимости от наличия коротких или расширенных N-концов
CNL-белки зачастую делят на 2 группы (RLPs-белки и RLKsбелки). Так, если цитоплазмический участок R-белка, имеющего
внеклеточный LRR-домен, включает протеинкиназный домен, то
R-белки относят к RLKs(receptor-like kinases)-белкам. Если вне-
клеточный LRR-домен отсутствует, то R-белки относят к RLPs(receptor-like proteins)-белкам.
Что касается выполняемых отдельными доменами R-белков
функций, то следует сказать, что функционирование R-белков
предусматривает как внутримолекулярные взаимодействия между
составляющими его доменами, так и взаимодействия R-белков
с другими белками для образования сигнального комплекса, который способен активировать иммунный отклик [321]. Так, LRRдомен, являясь самой крупной частью NB-LRR-белков, может
обеспечивать взаимодействие с другими белками, а значит быть
рецептором для белковых или пептидных эффекторов (элиситоров). Однако этот домен, чаще всего, напрямую не взаимодей-
77
ствует с элиситором. Сначала эффекторный элиситор связывается с определенными мишенями в цитоплазме клетки, делает
определенные изменения в ней и тем самым ингибирует иммунные PTI-отклики растения. А LRR-домен R-белка распознает такие изменения и отвечает ETI-откликами [16, 296]. Таким образом, LRRs-домен может играть ключевую роль в специфичности
распознавания [272, 366]. NB-участок является частью более
крупного домена NB-ARC, который может связывать нуклеотиды, способные действовать как молекулярные выключатели при
регулировании активности R-белка в процессе распознавания
патогена [353, 367]. Кроме того, NB-участок может участвовать
в регуляции экспрессии защитных генов [353]. Считается, что
протеинкиназный и нуклеотидсвязывающий участки на N-конце R-белка осуществляют передачу сигнала, возникшего вследствие взаимодействия с элиситором домена LRR на С-конце R-белка. CC-область может способствовать формированию структур,
участвующих в специфическом взаимодействии R-белка с другими белками, т. е. этот домен может быть вовлечен в сигналинг,
определяющий сигнальную специфичность [353].
ETI-сигналинг. Трансдукция распознанного R-белком сиг-
нала опасности может протекать различными путями [16, 268,
295, 296], в зависимости от микроба или вредителя (биотрофные
паразиты, некротрофные паразиты, травоядные насекомые, ризосферные бактерии). В целом, несмотря на то, что за прошедшее
десятилетие большие усилия были направлены на исследование
функций эффекторов и NB-LRR-рецепторов, точный механизм
NB-LRR-белковой активации и последующий ETI-сигналинг
остаются в основном не ясными. Тем не менее структурные исследования доменов NB-LRR-белков показали, что одним из ос-
новных факторов для активации защитного сигналинга является
рецепторная олигомеризация [273]. Действительно, большинство NB-LRR-белков детектирует эффекторные белки патогенов
путем ассоциации с другими белками растения, на которые нацелены эффекторы, т. е. не напрямую. Эти эффекторные мишени
играют ключевую роль в активации NB-LRR-белков [264, 268,
368]. В работах [360, 369, 370] было продемонстрировано, что
78
прямыми мишенями эффекторов являются регуляторные белки,
участвующие в PTI-сигналинге. Кроме того, было показано, что
большинство NB-LRRs могут активировать защитный сигналинг,
находясь в цитозоле [297], тогда как отдельные NB-LRRs – находясь в ядре [371, 372]. Наконец, следует отметить, что ETI проводится с использованием сигнального пути, связанного с таким
фитогормоном, как SA (SA-зависимый путь), который требуется,
в основном, против биотрофных патогенов. Фитогормон JA также
продуцируется в ответ на атаку патогена или поранение и необходим для защиты, главным образом, от некротрофных патогенов и травоядных насекомых [298].
2.2.3. Регуляция защитных откликов
и их взаимное влияние
Распознавание сигналов опасности и их трансдукция с последующей активацией соответствующих защитных откликов –
главные составляющие защитных механизмов растений, используемых ими для своего выживания и адаптации к окружающим условиям. Действительно, после распознавания сигнала
опасности растение должно обеспечить трансдукцию этого сиг-
нала от рецептора к мишеням, находящимся внутри клетки, то
есть запустить процесс, называемый «сигналингом» [47, 345].
Существует много различных сигнальных путей, с помощью
которых клетка распространяет сигнал опасности. Они интегрируются в сети, т. е. являются частью различных сигнальных систем, активируемых клеткой растения в зависимости от
вида микроорганизма, насекомого или от конкретного типа абиотического стресса [373, 374]. Таким образом, распознавание
клетками растений сигналов опасности запускает различные сигнальные системы, что приводит к активации экспрессии защитных генов, синтезу соответствующих белков, продуцированию
ФА и другим защитным откликам растений. Задачей таких сиг-
нальных систем является не только трансдукция, но и усиление
сигнала, при этом сигнальные системы используют различных
посредников, в качестве которых могут выступать отдельные
79
белки или их фрагменты, а также соединения иной химической
природы.
Фитогормоны и сигналинг. Ключевую роль в регуляции
сигнальной сети и, соответственно, защитного ответа растений
против патогенов и насекомых играют такие фитогормоны, как
SA, JA и ET [14, 303, 375]. Однако и другие гормоны, например
абсцизовая кислота (ABA, abscisic acid), ауксин (auxin), брассиностероиды (BR, brassinosteroids), гиббереллиновая кислота (GA,
gibberellic acid), цитокинин (CK, cytokinin), а также некоторые
пептидные соединения могут быть вовлечены в защитные механизмы растений, однако их роли в защите растений менее изучены [376, 377].
Салициловая кислота. SA впервые была выделена из ивы
еще в XIX столетии, и нашла различные применения, прежде
всего через свои многочисленные производные (салицилаты),
самая известная из которых – ацетилсалициловая кислота. Биосинтез салициловой кислоты в клетках растений изучен еще не
полностью. Считается [20], что он начинается с активизации фенилаланинаммиаклиазы (PAL, phenylalanineammonia-lyase), являющейся ключевым ферментом фенилпропаноидного метаболизма. PAL катализирует реакцию дезаминирования фенилаланина, что ведет к превращению фенилаланина в транскоричную
кислоту, являющуюся предшественником широкого круга метаболитов (фенолов, фенилпропаноидов и др.). Далее коричная
кислота превращается в бензойную или в ортокумаровую, из которых и образуется салициловая кислота [20, 378]. Кроме того,
было обнаружено, что в растениях наряду с основным путем
синтеза SA из фенилаланина имеется и другой путь ее образования через шикимовую, хоризмовую и изохоризмовую кислоты
[317]. Интересно, что SA накапливается в растительных тканях
только в ответ на инфицирование, но ее содержание не возрастает
в механически поврежденных тканях. SA играет центральную
роль в защите против биотрофных патогенов, ограничивая их
распространение с помощью реакции СЧ. Кроме того, SA участвует в биосинтезе фенольных соединений, PR-белков, а также
может быть вовлечена в сигнальные процессы, индуцирующие
80
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]