Полимеразная цепная реакция в диагностике инфекционных болезней животных. Учебно-методическое пособие

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение

высшего образования «Казанская государственная академия ветеринарной

медицины имени Н.Э.Баумана»

ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ В ДИАГНОСТИКЕ

ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ ЖИВОТНЫХ

Учебно-методическое пособие

кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии;

кафедрой микробиологии, вирусологии и иммунологии;

Галиуллин, П.В. Софронов. – Казань: ФГБОУ ВО Казанская ГАВМ, 2021. ­55 с.

Материал, изложенный в учебно-методическом пособии, является практическим руководством и включает общую информацию о принципах ПЦР, типах и вариантах проведения реакции. Пособие предназначено для студентов, обучающихся по специальности 36.05.01 – Ветеринария, магистров, обучающихся по направлению подготовки 36.04.01 ­Ветеринарно-санитарная экспертиза, студентов ФПК.

3 ТИПЫ И ВАРИАНТЫ ПРОВЕДЕНИЯ ПЦР 18

3.2 ВАРИАНТЫ ПРОВЕДЕНИЯ РЕАКЦИИ 25 4 ОРГАНИЗАЦИЯ ПЦР-ЛАБОРАТОРИИ 34 5 ОБОРУДОВАНИЕ И МАТЕРИАЛЫ ДЛЯ ПЦР 36 6 КОММЕРЧЕСКИЕ НАБОРЫ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ ЖИВОТНЫХ 46 Список использованных источников 55

РЕАКЦИИ

Открытие полимеразной цепной реакции стало одним из наиболее выдающихся событий в области молекулярной биологии за последние десятилетия. Это позволило поднять данную область науки на качественно новый уровень. Внедрение полимеразной цепной реакции в медицину открыло новое диагностическое направление – ДНК-диагностику.

В 1983 г. руководитель лаборатории синтеза ДНК в Cetus Corporation (США) Кэри Мюллис апрельской ночью ехал вдоль побережья из Сан­Франциско в Мендосино, в свой загородный дом. Долгой трехчасовой дорогой он обдумывал предстоящий эксперимент по секвенированию ДНК. И тут (по словам Мюллиса) его озарило: он ясно представил процесс амплификации (преумножения) генов, который позже получит название полимеразной цепной реакции (рисунок 2). Тогда же открылось совместное

предприятие PerkinElmer Cetus Instruments (PECI), которое выпустило первый прототип ПЦР-циклера — Mr. Cycle (рисунок 3).

Рисунок 2 – Кэрри Мюллис

Рисунок 3 - Mr. Cycle - первый прототип ПЦР-амплификатора

В 1993 году Кэри Мюллис стал лауреатом Нобелевской премии по химии за изобретение ПЦР. Его награждение — до сих пор больной вопрос для норвежского научного сообщества, где первооткрывателем метода считают Хьелля Клеппе.

микроорганизмы, живущие в гейзерах. Их ферментативная система, в частности ДНК-полимераза, выдерживает высокие температуры горячих источников и сохраняет свою биологическую активность после нагревания до 100°С. Использование программируемых термоциклеров, изменяющих температуру реакционной смеси по заданной циклической программе, и ферментов из термофильных микроорганизмов, существенно упростило проведение реакции, сделав еѐ рутинной процедурой.

Полимеразная цепная реакция представляет собой метод ферментативной наработки in vitro определѐнных, сравнительно коротких (от нескольких десятков до нескольких тысяч пар нуклеотидов), двухцепочечных фрагментов ДНК. В основе реакции лежит механизм, который в природе реализован при внутриклеточном удвоении (репликации) молекул ДНК ферментом ДНК-полимеразой.

Известно, что ДНК — это двухцепочечная молекула, где каждая цепочка состоит из звеньев-нуклеотидов. Нуклеотиды составлены из трех молекул: остатка фосфорной кислоты, сахара и азотистого основания. Если сахар и фосфат одинаковы у всех нуклеотидов в ДНК (в РНК сахар другой), то азотистых оснований четыре: аденин, тимин, цитозин и гуанин, обозначаемые А, Т, Ц и Г соответственно. В молекулах РНК тимин заменен урацилом. Нуклеотиды соединяются в цепочку, образуя связи между фосфатной группой одного нуклеотида и гидроксильной — другого. В результате на одном конце каждой цепи ДНК «висит» фосфатная группа (5ˊ-конец), а на другом — гидроксильная (3ˊ-конец). Две цепи нуклеотидов расположены в молекуле ДНК антипараллельно, то есть напротив 3ˊ-конца одной находится 5ˊ-конец другой. Чтобы молекула была стабильной, цепочки должны как-то взаимодействовать друг с другом. Это обеспечивают водородные связи, образующиеся между азотистыми основаниями противоположных цепей по принципу комплементарности: А соединяется только с Т (или У в РНК), а Г — с Ц (рисунок 4). И поэтому, имея одну цепь ДНК, в соответствии с этим правилом легко построить ее пару. Собственно, на этом и основана ПЦР.

Обработка биоматериала и выделение нуклеиновых кислот — это первый этап молекулярно-биологического исследования. В современном мире представляется возможным выделение ДНК из абсолютно любого доступного биологического материала, состоящего из клеток, имеющих, кроме прочего, в своем строении оформленное ядро. Генетический материал хранится в ядрах клеток, которые нужно разрушить, иначе ДНК не выйдет в раствор и будет недоступна для анализа. Чтобы анализ прошел успешно, важно очистить ДНК от примесей. Примеси ингибируют активность ферментов, которые нужны для подготовки образца к дальнейшим исследованиям.

содержащего нуклеиновую кислоту, требуется одна или несколько стадий отмывки. Осажденную ДНК выделяют путем повторного центрифугирования, причем избыток солей вымывается с помощью 70%-го этилового спирта, а центрифугирование необходимо для удаления супернатанта – этанола. Затем осажденную ДНК растворяют с помощью ТЕ­буфера или MQ-воды.