Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Полимеразная цепная реакция в диагностике инфекционных болезней животных. Учебно-методическое пособие
.pdf
фрагментов) на 5ˊ-конце несет небольшую последовательность,
соответствующую концу другого фрагмента, того, что будут пришивать.
1. Проводят две раздельные ПЦР — для каждого из фрагментов.
В результате последовательность, содержащаяся на 5ˊ-концах
«стыковочных» праймеров, уже входит в состав новообразованных
амплифицированных фрагментов.
2. Содержимое обеих пробирок смешивают и используют уже
только два праймера — для дальних (внешних) концов. Поскольку оба
фрагмента содержат на одном конце последовательности, комплементарные
друг другу, во время отжига праймеров фрагменты гибридизуются,
а их перекрывающиеся 3ˊ-концы служат праймерами. Таким образом
получаются длинные молекулы, состоящие из двух фрагментов.
Этот же вариант ПЦР, но с небольшими модификациями, используют
и для внесения мутаций, например, если из длинного фрагмента ДНК надо
удалить какой-то участок.
Сборочная ПЦР
Этот вариант похож на предыдущий. Его используют для сборки
синтетических молекул ДНК из отдельных фрагментов, например, чтобы
получить синтетические гены или даже целые геномы.
В сборочной ПЦР (assembly PCR) используют одноцепочечные
олигонуклеотиды длиной до 50 н., одна часть которых предназначена для
образования одной цепи ДНК, а другая — для образования другой. Важно,
чтобы эти олигонуклеотиды частично перекрывались концами (примерно
на 20 нуклеотидов) с «соседями» на будущей противоположной цепи,
поскольку они сами будут работать и праймерами, и матрицей. Во время
первых 30 циклов ПЦР концы олигонуклеотидов удлиняются по матрице
фрагментов противоположной цепи. К концу процесса каждый
олигонуклеотид удлинится настолько, что превратится в отдельную цепочку
будущей синтетической ДНК. Тогда в реакцию добавляют пару праймеров,
комплементарных концам этой ДНК, и проводят дополнительные 23 цикла,
получая на выходе множество копий синтетической ДНК.
Твердофазная ПЦР
Ее применяют, например, для получения ДНК-микрочипов или при
секвенировании на платформе Illumina. К твердой поверхности 5ˊ-концами
пришивают праймеры, добавляют реакционную смесь и проводят
твердофазную ПЦР (solid phase PCR). В первом цикле удлиняется некоторое
количество праймеров, затем проводят промывку, чтобы удалить свободно
плавающие в растворе ДНК-матрицы, добавляют новый раствор (но уже без
матриц) и продолжают ПЦР. Одноцепочечные ДНК, торчащие над
31
поверхностью, на этапе отжига изгибаются и гибридизуются с какими-то
из соседних праймеров, становясь матрицами для удлинения этих праймеров.
На этапе денатурации обе цепи расходятся, но всѐ равно остаются
прикрепленными к поверхности, так как представляют собой продолжения
праймеров.
In situ ПЦР
Это реакция, которую проводят непосредственно в клетках или тканях,
например, для изучения внутриклеточного развития вирусов. Сначала клетки
или ткань фиксируют на предметном стекле и обрабатывают протеазой,
чтобы расщепить белки и освободить ДНК (или РНК, если собираются
проводить ОТ-ПЦР). Затем прямо на стекло добавляют смесь для ПЦР
и ставят препарат в амплификатор. Выявляют получившиеся фрагменты либо
ДНК-гибридизацией, либо иммунологическими методами.
Капельная цифровая ПЦР
Цифровая ПЦР (digital PCR) — более точный и воспроизводимый
метод количественного определения ДНК, чем ПЦР в реальном времени.
Стандартная ПЦР проходит во всѐм объеме образца, а при цифровой пробу
делят на большое количество маленьких субъединиц (компартментов)
и проводят ПЦР в каждой из них отдельно. Методы разделения
на компартменты в различных технологиях цифровой ПЦР отличаются друг
от друга (используют масляную эмульсию, капилляры и т.д.), а реакцию
проводят в планшетах с микролунками. Результаты визуализируют чаще
всего с помощью системы TaqMan, но иногда применяют
и интеркалирующие агенты, например, зеленую флуоресцирующую краску
EvaGreen.
Метод цПЦР разработали австралийцы Алек Морли и Памела Сайкс
в 1992 году, когда исследовали больных лейкемией. В последующие годы
разные исследовательские группы разрабатывали свои варианты,.
К сожалению, все они имели существенный недостаток — высокую
трудоемкость: пробу надо было разделять на сотни (а то и тысячи) реакций
объемом по нескольку микролитров каждая или проводить дополнительные
реакции (например, иммобилизацию праймеров на магнитных шариках
и гибридизацию продуктов ПЦР с флуоресцентными пробами, как
в технологии BEAMing), а затем отдельно анализировать результаты.
От этих проблем экспериментаторов избавила капельная цифровая
ПЦР (кцПЦР), или по-английски droplet digital PCR (ddPCR).
В ddPCR из 20 мкл образца, в котором требуется определить
количество исследуемой ДНК, создают водно-маслянную эмульсию.
Реакционную смесь разделяют на приблизительно 20 000 капель-реакций
32
объемом около 1 нл каждая с помощью автоматического генератора капель
(рисунок 23). При этом генетический материал распределяется по каплям
случайным образом: в них попадают как ДНК-мишени, так и фоновая ДНК.
Процесс распределения целевой ДНК по каплям чисто случайный.
Капли вносят в 96-луночный планшет для ПЦР и помещают в циклер.
Реакция проходит независимо в каждой капле. В тех каплях, куда попала
ДНК-мишень, образуется ПЦР-продукт, что приводит к увеличению уровня
флуоресцентного сигнала от флуоресцентной метки: либо TaqMan-зондов,
либо интеркалирующего красителя. После ПЦР в специальном устройстве
(ридере) капли независимо друг от друга проверяют на наличие или
отсутствие в них флуоресцентного сигнала. Количество капель
с положительным и отрицательным сигналами подсчитывают для каждого
образца, а программное обеспечение выдает концентрацию ДНК-мишени
в виде числа копий в микролитре. Анализ продукта проходит в конечной
точке после проведения ПЦР.
Рисунок 22 - Схема цифровой ПЦР
Контрольные вопросы:
1. Какие типы ПЦР существуют?
2. Чем отличается ПЦР в реальном времени от классической ПЦР?
3. Перечислите варианты постановки полимеразной цепной реакции.
4. В чѐм заключается суть капельной цифровой ПЦР?
33
4 ОРГАНИЗАЦИЯ ПЦР-ЛАБОРАТОРИИ
Способность ПЦР нарабатывать ДНК даже с единственной подходящей
матричной молекулы накладывает определѐнные условия на организацию
лаборатории, использующей данную методику. Если лабораторное
оборудование или реактивы будут загрязнены продуктами предыдущих
реакций, это может привести к получению некорректных результатов
последующих ПЦР-исследований с теми же праймерами. Во избежание
загрязнения экспериментальных реакций ранее полученными фрагментами
(контаминации), исследователь должен соблюдать ряд требований при
работе с ПЦР.
1. Необходимо организовать отдельные помещения для этапов: 1)
очистки нуклеиновых кислот; 2) приготовления реакций (допустимо
объединение 1 и 2); 3) анализа продуктов амплификации.
2. Каждый из указанных выше этапов должен осуществляться
отдельным набором автоматических пипеток и с использованием
одноразовых расходных материалов.
3. Желательно использовать наконечники и пробирки с маркировкой
«DNAse and RNAse free».
4. Желательно, чтобы наконечники для пипеток были с фильтрами
(aerosol-resistant tips).
5. Каждый из процессов (очистка ДНК, приготовление реакции и, если
требуется, нанесение образцов после реакции в гель) необходимо выполнять
в новых одноразовых перчатках (без талька).
6. Необходимо избегать перемещения оборудования или реактивов из
одного помещения в другое (особенно из электрофоретической комнаты в
другие помещения).
7. Желательно проводить этапы приготовления реакций и
электрофорез силами разных сотрудников, а при выполнении всех этапов
одним сотрудником, желательно проводить гель-электрофорез в конце
рабочего дня, чтобы после электрофоретической комнаты не заходить в
комнаты для очистки ДНК и приготовления реакций.
8. Очистку ДНК и приготовление реакций желательно проводить в
ПЦР-боксах (или ламинарах с выключенным воздушным потоком, поскольку
воздушный поток повышает вероятность кросс-контаминации образцов) с
УФ-лампами, которые необходимо включать на ночь.
9. Желательно использовать собственный набор реактивов для ПЦР и
хранить эти реагенты в виде небольших порций (аликвот).
34
10. Необходимо включать в экспериментальную постановку
контрольные реакции: отрицательный контрольный образец, в котором есть
все компоненты реакции, кроме матричной ДНК, и положительный
контрольный образец, в котором реакция должна пройти обязательно
(отсутствие результата в положительном контрольном образце будет
свидетельствовать об ошибках в приготовлении реакции или испорченных
реактивах). Наличие продуктов амплификации в отрицательном контрольном
образце свидетельствует о загрязнении оборудования или реактивов
продуктами ПЦР предыдущих исследований.
Контрольные вопросы:
1. Перечислите требования к ПЦР-лаборатории и работе при постановке
ПЦР.
2. Почему для разных этапов ПЦР необходимо организовывать разные
помещения?
3. Для чего при постановке ПЦР включают контрольные образцы?
35
5 ОБОРУДОВАНИЕ И МАТЕРИАЛЫ ДЛЯ ПЦР
Материалы и оборудование, требуемые для выделения ДНК из
исследуемого материала (с указанием фирм-производителей):
1. Стерильный ламинарный бокс (например, «БАВп-01-«Ламинар-С»1,2», «Ламинарные системы», Россия).
2. Термостат для пробирок типа «Эппендорф» от 25 до 100 °С
(например, «ТЕРМО 24-15», «Биоком», Россия).
3. Вакуумный отсасыватель медицинский с колбой-ловушкой для
удаления надосадочной жидкости (например, «ОМ-1», г. Ульяновск, Россия;
FTA-1, BioSan, Латвия).
4. Микроцентрифуга для пробирок типа «Эппендорф» до 16 тыс.
об/мин (например, «MiniSpin», «Eppendorf», Германия).
5. Вортекс (например, «ТЭТА-2», «Биоком», Россия).
6. Отдельный набор автоматических дозаторов переменного объема
(например, «Ленпипет», Россия).
7. Одноразовые полипропиленовые завинчивающиеся или плотно
закрывающиеся микропробирки на 1,5 мл (например, «Axygen», США).
8. Штативы для микропробирок на 1,5 мл (например, Форма 1:REFК12-50, и др., «ИнтерЛабСервис», Россия) и наконечников (например,
«Axygen», США).
9. Одноразовые наконечники для пипеток переменного объема с
аэрозольным барьером или без него до 200 мкл и до 1000 мкл (например,
«Axygen», США).
10. Холодильник от 2 до 8°С с морозильной камерой не выше минус
16°С
Материалы и оборудование, требуемые для амплификации (с
указанием фирм-производителей):
1. Одноразовые полипропиленовые пробирки: плотно закрывающиеся
пробирки объемом 1,5 мл, тонкостенные пробирки для ПЦР объемом 0,2 мл
или 0,5 мл с выпуклой или плоской крышкой для приготовления
реакционной смеси; (например, Axygen,Inc., США, или аналогичные)
2. Одноразовые наконечники для дозаторов переменного объема с
фильтром до 100, до 200 мкл (например, Axygen, США, или аналогичные).
3. Штативы для пробирок объемом 0,2 мл или 0,5 мл (в соответствии с
используемыми комплектами реагентов) (например, Axygen, Inc., США, или
аналогичные).
36
4. Бокс абактериальной воздушной среды (ПЦР-бокс) (например,
«БАВ-ПЦР-«Ламинар-С.», ЗАО «Ламинарные системы», Россия, или
аналогичный).
5. Вортекс (например, SIA Biosan, Латвия, или аналогичный).
6. Автоматические дозаторы переменного объема (например, ООО
«Биохит», Россия, или аналогичные).
7. - Программируемый амплификатор для пробирок объемом 0,5 мл
(например, «Терцик», ООО «НПО ДНК-Технология», Россия); для пробирок
объемом 0,2 мл (например, GeneAmp PCR System 2700, Applied Biosystems,
США, или MaxyGene, Axygen, США, или др.) при работе с
электрофоретической детекцией;
- Программируемый амплификатор с системой детекции
флуоресцентного сигнала в режиме «реального времени», (например, RotorGene3000/6000 (CorbettResearch, Австралия), Rotor-Gene Q, (QIAGEN GmbH,
Германия), iCycleriQ/ iCycleriQ5 (Bio-Rad Laboratories, Inc., США) и другие) при работе с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме
«реального времени».
8. Холодильник от 2 до 8°С с морозильной камерой от минус 24 до
минус 16 °С.
Материалы и оборудование, требуемые для детекции продуктов
ПЦР-амплификации методом электрофореза в агарозном геле (с
указанием фирм-производителей):
1. Камера для горизонтального электрофореза объѐмом не более 400 мл
(например, «SE-2», «Хеликон», Россия).
2. Источник постоянного тока с напряжением 150 –460 В (например,
«Эльф-4», «ДНК-Технология», Россия).
3. Ультрафиолетовый трансиллюминатор с кабинетом для просмотра
гелей (например, «Биоком», Россия).
4. Видеосистема с цифровой камерой для регистрации (например,
«Биотест-1», «ЦНИИ Эпидемиологии», Россия; «BioRad», США).
5. Аквадистиллятор.
6. Холодильник от 2 до 8 °С.
7. Микроволновая печь для плавления агарозы.
8. Штатив для микропробирок на 0,5 мл (например,
«ИнтерЛабСервис», Россия).
9. Отдельный механический или электронный дозатор объемом 10-40
мкл (например, «Ленпипет», Россия).
37
10. Одноразовые наконечники до 200 мкл в штативе (например,
«Axygen», США) (таблица 1).
Контрольные вопросы:
1. Перечислите оборудование, необходимое на стадии выделения
нуклеиновых кислот.
2. Какие материалы и оборудование нужны на этапе амплификации?
3. Для чего нужен амплификатор (термоциклер)?
4. Для чего нужен трансиллюминатор?
38
Таблица 1. Оборудование и расходные материалы, необходимые на разных стадиях ПЦР
Оборудование, расходные материалы
Название
Назначение
Стерильный ламинарный бокс
Чистая работа с ДНК-пробами,
обеспечение защиты от контаминации
при выделении НК и приготовлении
реакционной смеси для ПЦР
Термостат для пробирок типа
«Эппендорф»
Поддержание постоянной
температуры образцов в пробирках,
помещенных в гнезда термоблока
39
Вакуумный отсасыватель
медицинский с колбой-ловушкой
Удаление следовых количеств
спирта/буфера со стенок пробирок при
выделении и очистке НК
Микроцентрифуга
Центрифугирование образцов при
выделении НК, осаждение
биологических компонентов
40
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]