Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Микробиология. Часть 1. Учебное пособие.pdf
21
минимально потребляющие воду. Большинство бактерий являются
гидрофитами.
В питательной среде должны присутствовать все элементы, из
которых строится клетка, и в такой форме, которую микроорганизм
способен усваивать. В больших количествах необходимы
макроэлементы (сера, фосфор, кислород) и микроэлементы (цинк,
никель, молибден).
Для роста микроорганизмов требуется и ряд дополнительных
условий: определенная концентрация некоторых химических веществ,
особенно ионов водорода, соотношение разных ионов, рН среды,
темп ература, осмотическое давление. Некоторые микроорганизмы
нуждаются в отдельных соединениях, которые сами синтезировать не
могут. Такие необходимые дополнительные вещества называют
факторами роста, их роль могут играть аминокислоты, витамины,
пурины.
Решающее значение для роста микроорганизмов имеет рН
среды. Большинство микроорганизмов лучше растет при рН 7,0.
Грибы предпочитают более низкие значения рН.
Большинство почвенных и водных бактерий лучше растут при
температуре от 20 до 45
спорообразующие бактерии предпочитают температуру выше 45
o
С (являются мезофилами). А
o
С
(являются термофилами). Термофилы обитают в горячих источниках,
гейзерах Камчатки, самонагревающихся скоплениях различных
органических материалов (в зерне, сене, навозе, компосте), в
продуктах, прошедших тепловую обработку. Психрофильные
бактерии растут при температуре ниже 20
o
С (жел езобактерии).
Психрофилы встречаются в полярных зонах, в северных морях, снегах
Арктики, на охлажденных продуктах. Термотолерантными называют
бактерии, которые могут расти в области средних температур, но
могут переносить и более высокие температуры.
К осмотическому давлению питательной среды большинство
бактерий проявляет большую устойчивость. Многие бактерии могут
расти на средах с содержанием солей от 0,1 до 10 %.
Всем аэробным бактериям в качестве акцептора необходим
кислород. Для бактерий, которые растут в тонких слоях жидкости в
присутствии воздуха, кислорода достаточно. В жидких средах при
большом объеме жидкости аэробные бактерии могут расти только на
поверхности. Для этого требуется аэрация. Микроорганизмы способны
использовать только растворенный кислород. Для роста строго
22
анаэробных бактерий исключается доступ кислорода воздуха. Для их
культивирования применяют прокипяченные, лишенные воздуха
питательные среды, закрытые без пузырьков сосуды, добавляют в
питательную среду различные вещества, поглощающие кислород.
Рост бактерий в статической культуре. Кривая роста. При
внесении бактерий в питательную среду они обычно растут до тех пор,
пока содержание какого-нибудь из необходимых им компонентов
среды не достигнет минимума, после чего рост прекращается. Если на
протяжении всего времени не прибавлять питательных веществ и не
удалять продуктов обмена, то получится статическая бактериальная
культура.
Кривая, описывающая зависимость логарифма числа клеток от
времени, называется кривой роста. Она имеет S-образную форму.
Различают несколько фаз роста, которые сменяют друг друга в
определенной последовательности (рис. 11).
Рис. 11. Фазы роста бактерий
Начальная фаза (лаг-фаза) охватывает промежуток времени
между началом роста и достижением максимальной скорости роста.
Продолжительность этой фазы зависит от предварительного
культивирования, возраста микроорганизма и от того, насколько
пригодна для роста данная питательная среда. В этот период в
бактериальных клетках содержание РНК увеличивается в 8-12 раз. Это
указывает на участие РНК и рибосом в синтезе необходимых
ферментных белков.
Экспоненциальная фаза роста характеризуется постоянной
высокойй скоростью деления клеток. Скорость деления во время этой
фазы зависит от вида бактерий и среды. Одни бактерии делятся через
23
каждые 15 минут при температуре 37
даже 5-
10 часов. Величина клеток и содержание белка в клетках
о
С, другие – через 6-150 минут,
остаются постоянными. В связи с тем что в этой фазе скорость
деления клеток относительно постоянна, эта фаза наиболее удобна для
определения скорости деления бактерий и изучения влияния факторов
внешней среды на данный вид.
Стационарная фаза наступает тогда, когда число клеток
перестает увеличиваться. Скорость роста зависит от концентрации
субстрата. Поэтому при уменьшении этой концентрации наблюдается
снижение скорости роста. Переход от экспоненциальной к
стационарной фазе роста происходит постепенно. Скорость роста
может снижаться и за счет большой плотности бактериальной
популяции или из-за накопления токсичных продуктов обмена. В
стационарной фазе могут происходить такие процессы, как
использование запасных веществ, синтез ферментов, кроме того,
быстро гибнут очень чувствительные клетки. Количество биомассы,
достигнутое в стационарной фазе, называют выходом или урожаем.
Рост в непрерывной культуре. В статической культуре
условия все время изменяются: плотность популяции бактерий
увеличивается, а концентрация субстрата уменьшается. Для многих
исследований необходимо дать возможность клеткам длительное
время находиться в фазе экспоненциального роста при постоянной
концентрации субстрата и неизменных прочих условиях. Добиться
этого можно путем многократного переноса клетки на новую
питательную среду. Той же цели можно добиться, если в сосуд,
содержащий популяцию растущих клеток, непрерывно вводить новый
питательный раствор и одновременно удалять из него
соответствующее количество бактериальной суспензии. Такой метод
положен в основу непрерывного культивирования в хемостатах и
турбидостатах (рис. 12).
Хемостат состоит из сосуда-культиватора, в который из
особого резервуара поступает с постоянной скоростью питательный
раствор. Благодаря аэрации и механическому перемешиванию в
культиваторе создаются оптимальные условия для снабжения
кислородом и быстрого распределения питательных веществ. По мере
поступления в сосуд питательного раствора из сосуда вытекает
бактериальная суспензия.
24
Рис. 12. Аппараты для культивирования микроорганизмов:
А – хемостат, Б – турбидостат
Работа турбидостата основывается на поддержании
постоянной плотности бактериальной суспензии или постоянной
мутности. Фотоэлемент, который измеряет мутность, регулирует через
систему реле поступление питательного раствора. В сосуде для
культивирования все питательные вещества содержатся в избытке, и
скорость роста бактерий приближается к максимальной.
Основные различия между статической и непрерывной
культурами:
1. Статическую культуру можно рассматривать как закрытую
систему, которая в своем развитии проходит все фазы роста. Каждый
из этих периодов характеризуется определенными условиями.
Автоматическое регулирование в статической культуре невозможно.
2. Непрерывная культура представляет собой открытую
систему, которая стремится к равновесию.
25
1.4.5. Спорообразование
Споры – это покоящиеся клетки, обладающие устойчивостью
к неблагоприятным факторам внешней среды, что необходимо
для сохранения вида. Спорообразование происходит почти
исключительно у палочковидных бактерий.
Спорообразующие бактерии аэробные и факультативноанаэробные – бациллы, анаэробные – клостридии. В клетке бактерий
образуется только одна спора. Спорообразование обычно
наступает при обеднении среды питательными веществами или при
накоплении в ней продуктов обмена. Перед спорообразованием в
клетке накапливаются запасные питательные вещества (белки,
липиды), образуется специфическое для спор вещество –
дипиколиновая кислота.
Спора развивается из части протопласта (цитоплазмы с
ядерным материалом) материнской вегетативной клетки. По мере
развития и созревания закладываются ее оболочки, число и толщина
которых у разных бактерий варьируется. Поверхность наружной
оболочки может быть гладкой либо с выростами. Процесс
спорообразования происходит в течение нескольких часов.
Стадии спорогенеза:
1) Подготовительная (прекращение синтеза белка, появление
липопротеидов, конденсация цитоплазмы).
2) Стадия предспоры (образование двухслойной
цитоплазматической мембраны).
3) Стадия образования оболочек (изнутри).
4) Стадия созревания споры.
Стадии прорастания споры:
1) Активация споры (повреждение оболочек).
2) Начальная стадия (начало формирования вегетативной
клетки).
3) Стадия роста.
Обычно споры имеют круглую или овальную форму,
располагаются в центре клетки, ближе к концу (субтерминально) или
на самом конце клетки (терминально). Центрально споры
располагаются у возбудителя сибирской язвы, субтерминально – у
возбудителей ботулизма, анаэробной инфекции, терминально – у
возбудителя столбняка. Диаметр спор может превышать ширину
26
клетки. Химический состав спор характеризуется низким содержанием
воды, калия и фосфора, высоким содержанием кальция и магния.
После созревания споры материнская вегетативная клетка
отмирает, оболочка ее разрушается, и спора высвобождается. Плотная
оболочка, малое содержание свободной воды, наличие дипиколиновой
кислоты способствуют большой устойчивости спор к физическим и
химическим воздействиям. Так, споры некоторых бактерий
выдерживают кипячение в течение нескольких часов, могут
длительное время сохраняться (десятки и сотни лет) в сухом
состоянии, более устойчивы по отношению к действию химических
ядов, радиации и других факторов внешней среды.
В благоприятных условиях споры прорастают в вегетативные
клетки. При этом они набухают вследствие поглощения воды,
активизируются их ферменты, усиливаются биохимические процессы,
приводящие к росту. Затем происходит растворение внешней
оболочки, и через образовавшееся отверстие молодая бактериальная
клетка выходит наружу.
1.5. Культивирование бактерий
Для изучения строения бактерий и их идентификации в
исследуемом материале применяется метод бактериоскопии – осмотр
микропрепаратов с помощью микроскопа. Подготовка к изучению
морфологии бактерий включает следующие основные этапы:
– забор биологического материала (соскоб с кожи и слизистых
оболочек, слюна, мазок из зева, мокрота, кровь, кал и др.);
– посев и выращивание микроорганизмов на питательных
средах,
– выделение чистых культур бактерий;
– приготовление микроскопических препаратов;
– окрашивание микроскопических препаратов;
– изучение препаратов с помощью микроскопа.
1.5.1. Классификация питательных сред
Питательными средами в микробиологии называют среды,
содержащие различные соединения сложного или простого состава,
которые применяются для размножения бактерий или других
микроорганизмов в лабораторных или промышленных условиях.
27
Питательные среды готовят из продуктов животного или
растительного происхождения. Большое значение имеет наличие в
питательной среде факторов роста, которые катализируют
метаболические процессы микробной клетки (например, витаминов
группы В, никотиновой кислоты).
Классификация питательных сред:
1) по составу – простые и сложные;
2) по консистенции – плотные, жидкие и полужидкие;
3) по назначению:
- основные (мясопептонный бульон или мясопептонный
агар);
- специальные (кровяной, сывороточный агар);
- элективные (среда Плоскирева, желточно-солевой
агар);
- дифференциально-диагностические (среда Гисса, Эндо,
хромогенные среды).
Питательные среды бывают естественными (свёрнутая
сыворотка крови, свёрнутый яичный белок) и искусственными.
Искусственные среды готовят по определенным рецептам из
различных настоев или отваров животного или растительного
происхождения с добавлением неорганических солей, углеводов и
азотистых веществ.
По консистенции питательные среды могут быть жидкими,
полужидкими и плотными. Основой для большинства питательных
сред является агар, который представляет собой продукт переработки
морских водорослей. Он плавится при температуре 80-86 °С,
затвердевает при температуре около 40 °С и в застывшем состоянии
придаёт среде плотность. Плотные питательные среды готовят путём
добавления к жидкой среде 1,5-2 % агара, полужидкие – путём
добавления 0,3-0,7 % агара. В некоторых случаях для получения
плотных питательных сред используют желатин (10—15 %). Ряд
естественных питательных сред (свернутая сыворотка крови,
свернутый яичный белок) сами по себе являются плотными.
Сухие питательные среды получают на основе достижений
современной биотехнологии. Они могут храниться в течение
длительного времени, удобны при транспортировке, имеют
относительно стандартный состав. Для приготовления сухих
питательных сред используют утратившие срок годности
28
кровезаменители, продукты биотехнологии (кормовые дрожжи,
кормовой лизин, виноградная мука).
По целевому назначению питательные среды подразделяются
на основные, элективные и дифференциально-диагностические среды.
Основные питательные среды. Применяются для
выращивания многих бактерий. Например, триптические гидролизаты
мясных, рыбных продуктов, крови животных или казеина, из которых
готовят жидкую среду — питательный бульон и плотную —
питательный агар. Основные среды также служат для приготовления
сложных питательных сред – сахарных, кровяных.
Элективные питательные среды. Предназначены для
избирательного выделения и накопления микроорганизмов
определенного вида (или определенной группы) из материалов,
содержащих разнообразную постороннюю микрофлору. При создании
элективных питательных сред исходят из биологических
особенностей, которые отличают данные микроорганизмы от
большинства других. Например, избирательный рост стафилококков
наблюдается при повышенной концентрации хлорида натрия,
холерного вибриона — в щелочной среде.
Примером элективной среды является среда Плоскирева – для
выделения шигелл и сальмонелл. В состав среды Плоскирева входят
ингибирующие вещества (желчные соли, бриллиантовый зеленый,
йод), вследствие чего она должна полностью подавлять рост
грамположительной флоры, значительно задерживать (первые 24 ч)
рост эшерихий и другой сопутствующей микрофлоры, подавлять
роение протея. Дифференцирующие свойства агара Плоскирева
основаны на изменении рН в кислую сторону при росте
лактозоферментирующих бактерий, которые образуют колонии
брусничного цвета (индикатор нейтральный красный).
Лактозоотрицательные бактерии вырастают в виде бесцветных или
слабоокрашенных колоний. Вегетирующие свойства среды
недостаточны для роста возбудителя дизентерии – Sh. Dysenteriae, как
и некоторых сальмонелл – (S. Cholerae suis, S. pullorum).
Дифференциально-диагностические питательные среды.
Применяются для разграничения отдельных видов (или групп)
микроорганизмов. Принцип построения этих сред основан на том, что
разные виды бактерий различаются по биохимической активности
вследствие неодинакового набора ферментов, а следовательно,
отличаются характером роста на среде.
29
Примером дифференциально-диагностической среды является
среда Эндо для выделения энтеробактерий. Основным реактивом,
важным для дифференциации, является основной фуксин, который
обесцвечивается в среде при добавлении сульфита натрия (Na
2SO3
).
Кроме того, присутствие в среде этих реагентов оказывает
ингибирующее действие на грамположительную микрофлору.
Бактерии, способные ферментировать лактозу, изменяют рН
среды в кислую сторону вследствие образования конечного продукта
расщепления — ацетилальдегида. Последний, реагируя с сульфитом
натрия, способствует появлению красного окрашивания. Поэтому
лактозоположительные бактерии вырастают в виде ярко-розовых и
красных колоний, часто с металлическим зеленоватым блеском.
Различают также синтетические и полусинтетические среды.
Синтетические среды содержат химически чистые вещества:
аминокислоты, минеральные соли, углеводы, витамины.
Полусинтетические среды дополнительно включают пептон,
дрожжевой экстракт и другие питательные вещества. Эти среды чаще
всего применяют в научно-исследовательской работе, а также
используют в микробиологической промышленности при получении
антибиотиков, вакцин и других препаратов.
1.5.2. Приготовление питательных сред
Основными продуктами, получаемыми из мяса животных и
используемыми для изготовления питательных сред, являются мясная
вода, мясной экстракт, ферментативные и кислотные гидролизаты.
Мясную воду (мясной настой, мясной инфуз) получают из
фарша, приготовленного из очищенной мышечной ткани. К фаршу
добавляют воду в отношении 1 : 2 и оставляют при 4 – 10
о
С на 18 – 24
часа, после чего смесь кипятят в течение одного часа и фильтруют для
отделения фарша.
Для приготовления широко используемых сред –– мясопептонного бульона (МПБ) и мясопептонного агара (МПА) к мясной
воде добавляют пептон и натрия хлорид в концентрациях 1 и 0,5 %,
соответственно.
Для культивирования патогенных микроорганизмов, особенно
требовательных к питательным средам, к мясо-пептонным средам
добавляют различные, обогащающие их компоненты –– кровь,
сыворотку, сахар, яичный желток и др.
30
Мясной экстракт получают главным образом при
продолжительной варке мясного фарша в автоклаве с последующей
выпаркой мясного бульона в вакуум-аппарате до образования
пастообразного продукта. Такой продукт содержит воды 18 %,
органических веществ –– 61 %, минеральных –– 21 %.
Важнейшим компонентом питательных сред являются
пептоны –– продукты ферментативного гидролиза белков мяса. В
микробиологической практике применяются пептоны, получаемые с
помощью пепсина, панкреатина, трипсина, используемых как в виде
частично очищенных, так и «сырых» препаратов. К «сырым»
препаратам относятся измельченные ткани желудков свиней и
поджелудочных желез свиней и рогатого скота. Под действием
указанных ферментов образуются пептоны, полипептиды различной
степени сложности и свободные аминокислоты. Однако следует
учитывать, что пептоны, получаемые с использованием препаратов,
содержащих пепсин, и препаратов, содержащих панкреатин,
различаются по глубине гидролиза белков.
Рыбные продукты используются для получения
высокопитательных сред для микроорганизмов, так как по
химическому составу мясо животных практически не отличается от
мяса рыб.
Казеин –– фосфорсодержащий белок, получаемый из
обезжиренного молока и являющийся наиболее полноценным видом
сырья для питательных сред. От других источников белка отличается
постоянством состава, содержит все аминокислоты и некоторые
витамины. Панкреатический гидролизат казеина (триптический
гидролизат, панкреатический перевар, триптический пептон,
панкреатический пептон казеина) получают с использованием
ферментов поджелудочной железы, пептический гидролизат
получают с использованием пепсина. Ферментативные гидролизаты
казеина содержат низкомолекулярные пептиды, аминокислоты, в том
числе и триптофан, соотношение которых в составе гидролизатов
варьируется в зависимости от способа их получения.
В качестве источника углерода, азота и других компонентов
для многих общеупотребительных и специальных питательных сред
используются продукты, получаемые из дрожжей: дрожжевая вода,
дрожжевой настой, дрожжевой автолизат, дрожжевой экстракт,
кислотные и ферментативные гидролизаты дрожжей. Для получения
этих продуктов используют главным образом хлебопекарные дрожжи