Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Микробиология. Часть 1. Учебное пособие.pdf
31
рода Saccharomyces и кормовые родов Candida и Torulopsis. Дрожжи
содержат до 53 % белка, 25 –
40 % углеводов и являются богатым
источником витаминов группы В, витамина Д и других факторов
роста –– пуриновых и пиримидиновых оснований. Белок дрожжей
сбалансирован по аминокислотному составу и по этому показателю
близок к животному белку.
Дрожжевые клетки содержат значительное количество
различных протеолитических ферментов (пепсиназа, триптаза, эритаза
и др.), под действием которых в определенных условиях происходит
автолиз клеток и высвобождение из них белков в виде пептонов,
альбумоз, а также аминокислот, нуклеиновых кислот и др. Эти
компоненты определяют состав автолизата, сопоставимый с
триптическим гидролизатом других белков,
в том числе и по
содержанию аминного азота. Дрожжевые экстракты представляют
собой водные экстракты из дрожжей, которые предварительно
гидролизуют или подвергают автолизу. Дрожжевой экстракт и
дрожжевой автолизат выпускаются в виде густых сиропов или в виде
сухих мелкодисперсных порошков.
Гидролизаты дрожжей получают с помощью ферментов или
кислот. Ферментативные гидролизаты получают с использованием
поджелудочной железы или панкреатина, кислотные гидролизаты
получают с использованием фосфорной или соляной кислот. По
основному химическому составу, а именно содержанию общего и
аминного азота, пептонов, триптофана, дрожжевые гидролизаты
сходны с мясными гидролизатами, к тому же пептонов в дрожжевых
гидролизатах больше, чем в мясных. На бульонах из гидролизатов
дрожжей хорошо проявляется рост энтеробактерий, кокков и
коринебактерий. В качестве основ для питательных сред используют
продукты, получаемые из растительного сырья, и прежде всего из
бобов сои, богатых белком, витаминами, минеральными веществами.
Из значительного числа таких продуктов преимущественное
использование в практике изготовления питательных сред нашли
ферментативные и кислотные гидролизаты сои (пептоны).
Ферментативный гидролиз осуществляют с использованием
пепсина, папаина, панкреатина, а кислотный –– с использованием
соляной кислоты. Высокая питательная ценность этих гидролизатов
(пептонов) подтверждается тем, что, например, на средах с
папаиновым гидролизатом сои и без добавления сыворотки и
факторов роста, хорошо растут стрептококки, гонококки и другие
32
требовательные бактерии. Соевый бульон в некоторых случаях может
заменить мясной бульон.
Таким образом, все вышеуказанные продукты обработки мяса
животных, рыбы, казеина, дрожжей, растительного сырья
представляют собой органические источники углерода и азота.
В микробиологии используют, как правило, только стерильные
питательные среды. В настоящее время известно много способов их
стерилизации, которые разделяют на две основные группы:
термическую и холодную стерилизацию. Из термических способов
наиболее широко используются стерилизация насыщенным паром под
давлением (автоклавирование), стерилизация текучим паром,
тиндализация и кипячение.
1.5.3. Правила посева на питательную среду
Для эффективного роста микроорганизмов используемая
питательная среда должна отвечать определённым требованиям:
– содержать все необходимые для размножения
микроорганизмов вещества в легкоусвояемой форме;
– иметь оптимальные характеристики (влажность, вязкость, рН);
– быть изотоничной и по возможности прозрачной.
Жидкий материал для посева берут петлей или пипеткой. При
взятии петлей жидкость должна образовать в кольце петли тонкую
прозрачную пленку –– «зеркало». Пипетками пользуются в том
случае, когда материал засевают в большом или точно отмеряемом
объеме. Способ взятия плотного материала определяется его консистенцией. При посевах чаще всего пользуются бактериальной
петлей. Все манипуляции, связанные с посевом и выделением
микробных культур, производят над пламенем горелки.
Бактериальную петлю прокаливают над пламенем непосредственно
перед взятием материала, затем петлю остужают. Для этого при
пересеве микробной культуры с пробирки горячую петлю погружают
в конденсационную жидкость, а при пересеве с чашек Петри
прикасаются к поверхности питательной среды, свободной от
микробного роста. Достаточно остуженная петля не вызывает
шипения конденсационной жидкости и не растапливает агар при
соприкосновении со средой. После окончания посева петлю
прожигают повторно для уничтожения находящейся на ней микробной
культуры или инфицированного микроорганизмами материала.
33
Пипетки и шпатели, используемые для посевов, опускают в
дезинфицирующий раствор. После посева на чашках Петри со
стороны дна на пробирках в верхней трети надписывают название
засеянного материала, ставят номер анализа и дату посева.
Посев материала на питательную среду осуществляется
разными способами: петлёй, шпателем, тампоном и др.
Посев петлёй. Посевной материал втирают петлей по
поверхности среды у края чашки. Избыток снимают, а оставшийся
материал рассеивают параллельными штрихами по всей поверхности
агара.
Посев шпателем. Материал наносят петлей или пипеткой,
затем стеклянным или металлическим шпателем тщательно втирают
его по всей поверхности среды.
Посев тампоном. Тампон с исследуемым материалом
помещают в чашку и круговыми движениями втирают его содержимое
в поверхность среды, одновременно вращая тампон и чашку.
Посев на секторы. Дно чашки делят на секторы. Посев
производят зигзагообразными движениями от края чашки к центру,
так чтобы штрихи с одного сектора не переходили на другой.
Посев газоном. 1 мл исследуемого материала (жидкая
бульонная культура или взвесь микробов в физиологическом растворе)
наносят пипеткой на поверхность среды и тщательно распределяют по
всей поверхности. Избыток материала отсасывают пипеткой. После
посева чашки закрывают и кладут вверх дном. Надписи на чашках
делают со стороны дна, на пробирках – в верхней части. При посеве на
жидкую среду петлю слегка погружают в жидкость и растирают
посевной материал по стенке пробирки, после чего смывают средой.
1.5.4. Особенности роста бактерий на питательных средах
На жидких питательных средах рост бактерий вызывает
помутнение среды. Вследствие роста бактерий может образовываться
осадок придонный или пристеночный, а также плёнка на поверхности
среды. На плотных питательных средах образуются колонии.
Колония – изолированное скопление микроорганизмов одного
вида на плотной питательной среде. Типы колоний:
– S-гладкие – круглая форма, ровные края, гладкая поверхность;
– R-колонии – шероховатые, неровные края и поверхность;
34
– SR-колонии промежуточные – слегка неровные края и
поверхность.
Колонии характеризуют по величине, форме, контуру края,
рельефу, поверхности, цвету, структуре и консистенции.
Величина колонии определяется ее диаметром. В зависимости
от диаметра различают колонии точечные (диаметр меньше 1 мм),
мелкие (диаметр 1—2 мм), средние (диаметр 2—4 мм) и крупные
(диаметр 4—6 мм и более).
Форма колонии бывает правильной — круглой, неправильной
(амебовидной), ризоидной — корневидной, напоминающая
переплетающи еся корни деревьев.
Характер контура края определяют при рассмотрении
колонии под лупой или микроскопом с малым увеличением.
Различают ровные края в виде четко выраженной линии и неровные.
Неровные края бывают:
– фестончатыми, состоящими из крупных, слегка округлых или
уплощенных зубцов правильной формы;
– волнистыми, отличающимися от фестончатых тем, что зубцы
выражены нечётко;
– эрозированными или зазубренными, состоящими из острых
зубцов различной величины и формы;
– бахромчатыми, имеющими нежные ворсинки.
Рельеф колонии характеризуется приподнятостью её над
поверхностью питательной среды и контуром формы в вертикальном
разрезе. Различают:
1) каплеобразные и куполообразные колонии правильной круглой
формы с различно выраженной степенью выпуклости, которые в
вертикальном разрезе представляют собой сегмент шара и отличаются
только длиной радиуса. Колонии слабовыпуклые имеют большую
длину радиуса; куполообразные — меньшую;
2) колонии плосковыпуклые с плоским верхом, пологими или
круто обрывающимися краями имеют в вертикальном разрезе форму
трапеции;
3) колонии конусообразные, имеющие в вертикальном разрезе
форму треугольника;
4) колонии с приподнятой в виде соска серединой и валиком по
периферии;
5) колонии с вдавленным центром;
6) колонии плоские, стелющиеся по поверхности среды.
35
Поверхность колоний бывает матовая или блестящая с
глянцем, сухая или влажная, гладкая или шероховатая. Гладкие
колонии обозначают буквой S (smooth), шероховатые — буквой R
(rough), что означает соответственно “гладкий” и “шероховатый”.
Цвет колонии определяется пигментом, который продуцирует
культура микробов. Преобладающее большинство патогенных
бактерий пигмента не образует, вследствие чего колонии их бесцветны
или молочно-мутного цвета, похожи на опал. В проходящем свете
такие колонии в большей или меньшей степени прозрачны.
Пигментообразующие виды микробов дают колонии различных
цветов: кремовые, желтые, золотисто-оранжевые, синие, красные,
сиреневые, черные и др.
Структура колоний определяется в проходящем свете при
слабом увеличении микроскопа, суженной диафрагме или при
несколько опущенном конденсоре. У пигментированных колоний и
колоний, не пропускающих света, она не определяется.
По структуре различают следующие виды колоний:
1) гиалиновые — бесцветные, прозрачные, без видимой
определенной структуры;
2) зернистые, которые в зависимости от величины зерен
разделяются на мелко - и грубозернистые;
3) нитевидные или волокнистые, характеризующиеся наличием
длинных, густо переплетающихся нитей в толще колонии.
Колонии бывают однородные и неоднородные. Строение
первых одинаково во всех частях, у вторых центральная часть
отличается от периферической или отдельные сектора имеют
строение, неодинаковое с остальной массой.
Консистенцию колонии, определяющую ее физическое
состояние, исследуют посредством прикосновения или взятия из нее
части материала бактериальной петлей. По характеру консистенции
колонии бывают:
1) пастообразные, легко снимающиеся и размывающиеся по
поверхности питательной среды, наподобие сливочного масла;
2) вязкие или слизистые, прилипающие и тянущиеся за петлей;
3) волокнистые или кожистые, плотные, снимающиеся с
поверхности питательной среды в виде упругой пленки, соответствующей величине и форме колонии;
4) хрупкие, сухие, рассыпающиеся при прикосновении петли.
36
Особенности микробного роста на жидких питательных
средах. На жидких питательных средах характер роста микробов
менее разнообразен, чем на плотных питательных средах. Однако и
здесь выявлены следующие формы роста бактерий.
1. Рост бактерий с равномерным помутнением среды, цвет
которой остается неизмененным или изменяется в соответствии с
цветом водорастворимого пигмента, образующегося в культуре
микроба. Такой рост характерен для многих патогенных бактерий,
относящихся к группе факультативных анаэробов.
2. Придонный рост бактерий характеризуется образованием
осадка на дне пробирки с жидкой питательной средой. Осадок может
быть скудным или обильным, крошковидным, гомогенным,
волокнистым или в виде крупных рыхлых хлопьев, по консистенции
вязким, слизистым, хрупким или пастообразным. Питательная среда
над осадком может быть прозрачной или мутной. Цвет осадка и среды,
находящейся над ним, определяется наличием пигмента,
продуцируемого культурой микробов. Если культура пигмента не
образует, цвет среды не изменяется, а осадок приобретает, как правило, серовато-белый или желтоватый цвет. Придонный рост
специфичен для бактерий с анаэробным типом дыхания.
3. Пристеночный рост бактерий выражается в том, что
питательная среда, находящаяся в пробирке, остается совершенно
прозрачной. Бактерии растут, образуя более или менее крупные
рыхлые хлопья или, наоборот, компактные зерна, прикрепленные к
внутренней поверхности стенок сосуда, с которых в зависимости от
вида бактерий снимаются легко или с трудом.
4. Поверхностный рост бактерий характеризуется появлением
на поверхности жидкой питательной среды пленки, внешний вид и
характер которой могут быть различны:
а) пленка тонкая, нежная, бесцветная, имеет вид едва
заметного налета, исчезающего при встряхивании пробирки и
взбалтывании среды;
б) пленка влажная, толстая, хорошо видимая простым глазом,
вязкой, слизистой консистенции, прилипает к петле и тянется за ней;
в) пленка плотная, сухая, внешним видом напоминает кусочки
кожи и при попытке взятия из нее материала снимается целиком в
виде круглого диска, соответствующего диаметру пробирки:
г) пленка плотная, сухая, со сморщенной, а иногда бородавчатой поверхностью, краями прикрепленная к стенкам сосуда; при
37
взбалтывании жидкости или прикосновении бактериальной петли
разбивается на кусочки, погружающиеся в глубь жидкости.
Цвет пленки, как и питательной среды, зависит от пигмента,
вырабатываемого растущей культурой микробов. Рост бактерий в виде
поверхностной пленки характерен для микробов-аэрофилов.
Рост на полужидкой питательной среде. Для выявления
особенностей микробного роста на полужидкой питательной среде
исследуемую культуру засевают в столбик 0,2—0,5 % полужидкого
агара. Для того чтобы особенности роста проявлялись наиболее четко,
прокол среды делают в непосредственной близости к стенке пробирки.
Посев, произведенный таким образом, дает возможность выявить
подвижные расы микробов и дифференцировать их от неподвижных.
Подвижные микробы в столбике полужидкого агара вызывают
выраженное помутнение, распространяющееся более или менее
равномерно по всей толщине среды. Неподвижные формы
микробов растут только по ходу прокола среды, напоминая сосульки
цилиндрической или конической формы. При этом окружающая среда
остается совершенно прозрачной.
Особенности роста конкретных бактерий – см. в главе
«Частная бактериология».
1.6. Приготовление и окрашивание микропрепаратов
Приготовление препаратов микроорганизмов включает в себя
четыре основных этапа: приготовление мазка, высушивание,
фиксацию и окрашивание. Для приготовления мазка исследуемый
материал распределяют тонким слоем по поверхности хорошо
обезжиренного предметного стекла. Приготовленный мазок
высушивают на воздухе и после полного высыхания фиксируют.
При фиксировании мазок закрепляется на поверхности
предметного стекла, и поэтому при последующей окраске препарата
микробные клетки не смываются. Кроме того, убитые микробные
клетки окрашиваются лучше, чем живые. Фиксация мазка проводится
физическим и химическим способами. В основе физического способа
фиксации лежит воздействие высокой температуры на микробную
клетку. Химические способы фиксации предусматривают применение
химических средств, вызывающих коагуляцию белков цитоплазмы
микробных клеток.
38
Физический способ фиксации мазка. Предметное стекло с
препаратом берут пинцетом или 1-м и 2-м пальцами правой руки за
рёбра мазком кверху и плавным движением проводят 2—3 раза над
верхней частью пламени горелки. Весь процесс фиксации должен
занимать не более двух секунд. Надёжность фиксации проверяют
следующим образом: свободную от мазка поверхность предметного
стекла прикладывают к тыльной поверхности левой кисти. При
правильном фиксировании мазка стекло должно быть горячим, но не
должно обжигать кожу.
Химический способ фиксации мазка. Для химической
фиксации мазка применяют:
– метиловый спирт;
– ацетон;
– смесь Никифорова (смесь этилового спирта 96 %-ного и
наркозного эфира в соотношении 1:1);
– жидкость Карнуа (смесь этилового спирта 96 %-ного, который
составляет 60 %, хлороформа — 30 %, ледяной уксусной
кислоты — 10 %);
– спирт-формол (40 %-ного формалина 5 мл, этилового спирта
96 %-ного — 95 мл).
Предметное стекло с высушенным мазком погружают в
склянку с фиксирующим веществом на 10—15 мин и затем
высушивают на воздухе. Применяется также фиксация в парах 40 %ного формалина в течение нескольких секунд.
Методики окрашивания микропрепаратов. Основаны на
морфологических и биохимических свойствах исследуемых
микроорганизмов. Основной методикой, применяемой для
окрашивания большинства бактерий, является окраска по Граму,
предложенная в 1884 году датским врачом Г.К. Грамом. Эта методика
позволяет дифференцировать бактерии по биохимическим свойствам
их клеточной стенки. Для окраски используются анилиновые
красители: генциановый фиолетовый и метиловый фиолетовый.
Методика окраски по Граму:
– окрасить мазок генцианвиолетом в течение 2 мин через
фильтровальную бумагу, затем бумагу удалить, оставшуюся
краску слить;
– окрасить мазок раствором Люголя (1 мин);
39
– раствор Люголя слить и нанести несколько капель чистого
96%-ного спирта (30-40 с, осторожно покачивая стекло);
– тщательно смыть спирт водой;
– окрасить водным фуксином в течение 2 мин, промыть водой и
высушить.
Грамположительные бактерии окрашиваются в сине-
фиолетовый цвет, грамотрицательные – в розово-красный.
Методика окраски кислотоустойчивых бактерий по Цилю-
Нильсену. Кислотоустойчивые микроорганизмы обладают выраженной
устойчивостью к неорганическим кислотам, спиртам, щелочам. Это
связано с наличием в их клеточной стенке большого количества
липидов. Бактерии этой группы очень плохо окрашиваются обычными
способами, поэтому используют концентрированные растворы с
подогревом. При последующей обработке кислотой клетки,
воспринявшие краску, не обесцвечиваются. Это позволяет отличить
кислотоустойчивые бактерии.
Методика Циля-Нильсена:
– нанести несколько капель карболового фуксина на
фиксированный мазок, покрытый фильтровальной бумагой, и
подогреть до появления паров (3-5 мин);
– бумагу снять, мазок охладить и обесцветить 3 % серной
кислотой или 3 % солянокислым спиртом (3-4 с);
– тщательно промыть водой;
– окрасить дефферовской синькой (3-5 мин);
– промыть водой и высушить.
Методика окраски спор по Ожешко. Зрелая спора с трудом
поддается окрашиванию из-за низкой проницаемости стенки. При
окраске по Граму спорообразующей культуры краска воспринимается
только вегетативной частью микроба, а спора остается бесцветной.
Проницаемость ее клетки резко увеличивается после обработки
горячей соляной кислотой или при использовании
концентрированного раствора краски с подогревом. Восприняв краску,
спора при последующей обработке кислотой не обесцвечивается, в то
время как вегетативные клетки немедленно отдают краску.
Методика Ожешко:
– нанести несколько капель 0,5 % соляной кислоты на
нефиксированный мазок и нагреть до появления паров (2-3
мин);
– слить кислоту, промыть водой, высушить;
40
– зафиксировать в пламени;
– окрасить по методу Циля-Нильсена (при этом споры
окрашиваются в красный цвет, а вегетативные формы – в
синий). Часто для окраски спор используют только метод
Циля-Нильсена.
Окраска включений волютина по Нейссеру:
– окрасить мазок уксуснокислой синькой Нейссера (2-3 мин);
– промыть;
– окрасить раствором Люголя (30 с);
– слить раствор Люголя и окрасить везувином (1 мин);
– промыть препарат и высушить.
Цитоплазма клетки, имеющая кислую реакцию, окрашивается
в желтый цвет, зёрна волютина – в темно-синий, почти черный цвет.
Окраска по Бурри (обнаружение капсул).
Для обнаружения
капсул используют негативную окраску, т.к. окрашивается
пространство между бактериями. Таким образом, образуется темное
поле с неокрашенными бактериями.
– смешать на предметном стекле немного капсульной культуры
и каплю разведенной (1:9) туши;
– высушить на воздухе.
Модификация по Бурри-Гинсу включает создание фона краской
конгорот, последующую фиксацию в 5% растворе соляной кислоты,
дополнительную окраску водным фуксином. В результате – общий
фон тёмный, капсулы бесцветны, сами бактерии – красные.
Окраска по Романовскому-Гимзе относится к сложным
методам окрашивания и применяется чаще всего для мазковотпечатков из органов или мазков крови после фиксации в жидком
фиксаторе. Позволяет выявить ядерные элемен ты бактериальных
клеток и зерна волютина.
Для окрашивания берут каплю готовой краски на 1 мл воды,
которая должна быть подщелочена до рН – 7,2.
– поместить препарат (мазком вниз) в чашку Петри, подложив
под края стекла спички или кусочки предметных стекол;
– подлить краску сбоку так, чтобы она без пузырей подтекла под
мазок (красить 1-24ч);
– промыть водой (рН – 7,2) и высушить.
Цитоплазма молодых клеток окрашивается в сине-фиолетовый
цвет, ядерные элементы – в красно-фиолетовый.