Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Иностранный язык (английский). Учебно-методическое пособие
.pdf
Окраска по Н.А. Михину. Фиксированный мазок (преимуще-
ственно из крови или селезеночной пульпы) окрашивают леффлеровской метиленовой синькой в течение 2 - 3 мин, при этом мазок
подогревают до появления паров. Краску быстро смывают водой, а
мазок высушивают фильтровальной бумагой. Краску необходимо
смывать водой очень быстро, так как вода извлекает из капсул красящее вещество. Капсулы при этом светло-розовые, бациллы - темно-синие (рисунок 30).
Рисунок 30 – Окраска по Н.А. Михину
В результате жизнедеятельности возбудителя в крови снижа-
ется содержание кислорода, нарушается кислотно - щелочное равновесие, кровь теряет способность к свертыванию.
Глубокие изменения в организме, возникающие под влиянием
образовавших капсулу бацилл сибирской язвы. Приводят к гибели
заболевших.
Окраска по Ионе. Мазок, изготовленный обычным порядком,
окрашивают 2% водным раствором генциановиолета в течение 1-2
мин при легком нагревании, затем быстро промывают водой и обрабатывают 2% водным раствором уксусной кислоты в течение 10с.
Промывают водой и высушивают. Препарат можно также, не высушивая после промывания, покрыть предметным стеклом и рассматривать под микроскопом. При этом способе капсулы окрашиваются в темно-красный, а бациллы - в темно-синий цвет.
Можно применить окраску по Фоту. На препарат наносят 2-3
капли готовой краски Гимза, через 30 с ее равномерно смешивают с
20 каплями воды, после отстаивания 1-7 мин краску сливают, а ма-
41
зок просушивают. Капсулы - розовые или бледно-розовые, бациллы
- темно-синие.
При проведении исследований на сибирскую язву важным является обнаружение спор. Следует учитывать, что споры имеют
очень плотную оболочку, препятствующую проникновению красящих веществ.
Хорошие результаты дает применение окраски по методу
Шеффера и Фултона. На фиксированный на пламени мазок наливают 5% водный раствор малахитовой зелени, который находится
на мазке не более 1 мин. При этом мазок надо 3-4 раза подогреть
(до появления паров). Краску смывают проточной водой, после чего наливают 0,5% водный раствор сафранина на 30 с. Мазок промывают водой и высушивают фильтровальной бумагой. Споры зеленые, вегетативные клетки – красные (рисунок 31).
Рисунок 31 – Окраска по методу Шеффера и Фултона
Хорошие результаты получают при окраске спор по способу
Пешкова. Следует заметить, что этот способ прост для выполнения. Мазок фиксируют на пламени, после чего окрашивают кипящей синькой Леффлера над пламенем горелки в течение 15 - 20с,
смывают водой и докрашивают 0,5% водным раствором нейтральтора в течение 30 с, промывают водой и высушивают.
При окраске по Пешкову споры приобретают голубой или синий цвет, молодые споры окрашиваются более интенсивно и имеют
темно-синий, почти черный цвет, протоплазма вегетативных форм
розовая.
42
Люминесцентная микроскопия
В последнее время все большее значение приобретают исследования при помощи люминесцентной микроскопии. Сущность
метода, основан на том, что после обработки препарата люминесцирующей сывороткой под люминесцентным микроскопом выявляется специфическое свечение возбудителя
Для приготовления мазков используют 5 - 6-часовую бульонную или агаровую культуру. Мазки фиксируют в 96° спирте в течение 15 мин. Затем на препарат наносят каплю флуоресцирующей
сыворотки, специально предназначенной для люминесцентной
микроскопии возбудителя сибирской язвы.
Обычно пользуются сывороткой, разведенной физиологическим раствором в 2 раза.
Если флуоресцирующая сыворотка сухая, ее разводят дистиллированной водой в соответствии с объемом высушенной сыворотки, а затем готовят на физиологическом растворе необходимое разведение (рисунок 32).
Рисунок 32 - Люминесцентная микроскопия возбудителя сибирской язвы
Во избежание высыхания мазок на 10 — 15 мин оставляют во
влажной камере. С этой целью его помещают в чашку Петри, на
дно кладут смоченную вату. Потом каплю флуоресцирующей сыворотки стряхивают с препарата, а мазок тщательно промывают по
10 мин в физ-растворе или проточной воде.
43
Перед просмотром на препарат под покровным стеклом нано-
сят каплю глицерина. Препарат изучают под иммерсионным объективом люминесцентного микроскопа.
В положительных случаях в мазках обнаруживают характер-
ное свечение периферии клетки.
Бактериологические исследования
При характеристике возбудителя уже указывалось, что он тре-
бователен к питательным средам и условиям выращивания и хорошо растет на обычном мясо-пептонном агаре и бульоне.
Посевы из присланного на исследование материала производят
на МПА в бактериологических чашках и на МПБ в пробирках, которые помещают в термостат при температуре 37-38°. При обильном посеве рост будет выявляться уже через 16 - 18 ; повторный
просмотр посевов - через 24ч.
Отбирают подозрительные колонии, из которых делают мазки,
окрашивают их и микроскопируют.
Одновременно с посевом исследуемого материала на питательные среды проводят биологическую пробу. Для этого материал, подлежащий исследованию, суспендируют в небольшом объеме
физиологического раствора и вводят белым мышам подкожно в
область спины (корень хвоста) в дозе 0,1 - 0,3 мл. Гибель мышей
наступает через 24 - 36 ч. Павших животных вскрывают и производят бактериологическое исследование. Если мыши не погибли в
указанные сроки, их оставляют под наблюдением в течение десяти
суток, после чего забивают.
Бактериологические исследования включают подробное изучение выделенных культур. При этом следует учитывать морфологическое сходство возбудителя сибирской язвы со многими представителями сапрофитной бациллярной флоры и проводить дифференциально-диагностические исследования с особой тщательностью. Прежде всего, выделенную культуру исследуют на подвижность, помня, что возбудитель сибирской язвы неподвижен.
Хорошие результаты при определении подвижности дает посев исследуемой культуры в полужидкой 0,25% агар. Рост неподвижных микроорганизмов наблюдается по линии посева, а подвижные растут по всей питательной среде.
Большое диагностическое значение имеет определение гемолитической активности культуры. Возбудитель сибирской язвы,
гемолиза на питательной среде не вызывает. Исследуемую культу-
44
ру высевают на МПА, содержащий 5 - 105 дефибринированной
крови барана или других животных (рисунок 33).
Рисунок 33 – Посев на МПА с добавлением крови барана
Посевы на кровяной агар инкубируют при температуре 35 -
37°С в течение 18 - 20 ч, после чего производят учет.
Для определения гемолитической активности можно использовать также среду Буза, которая состоит из 3% голодного(без пептона) агара, к которому добавлено 15% дефибринированной крови
барана.
В последние годы в результате исследований, проведенных в
разные годы, разработана проба с пенициллином, или тест «жемчужного ожерелья». Эта проба основана на том, что при росте на
мясо-пептонном агаре, содержащем пенициллин, происходит деформация клеток возбудителя сибирской язвы, бациллы распадаются на отдельные шарики, располагающиеся в виде цепочек (рисунок 34).
Наиболее распространенной является такая методика постановки пробы. Трехчасовую бульонную культуру засеивают на
МПА в две чашки, содержащие в 1 мл по 0,05 единицы пенициллина, и в третью - без пенициллина. Посевы находятся в термостате в
течение трех часов. Выросшие культуры подвергают исследованию
под микроскопом.
45
Рисунок 34 – Возбудитель сибирской язвы
В чашке с пенициллином микробы принимают шаровидную
форму, а в чашке без пенициллина нормальные бациллы.
Для идентификации выделенных культур изучают также их
лизабельность бактериофагом. Исследование производится на
МПА в чашках Петри. Трех-, четырехчасовые бульонные культуры
изучаемых штаммов наносят на агаровую пластинку и отмечают
эти места. После 30-минутного подсыхания на засеянную зону наносят по капле сибиреязвенного бактериофага без разведения. Затем чашки помещают в термостат при температуре 37°. Учет действия начинают проводить через 6 - 18 ч. В случае положительного
результата на месте нанесения капли бактериофага отмечается лизис колоний.
Промышленность выпускает для диагностики сибиреязвенный
фаг «Гамма MB А», официальное наставление по применению этого фага дает следующие рекомендации.
Для идентификации культуры сибирской язвы в шесть пробирок со скошенным МПА без конденсационной влаги наносят по
одной капле испытуемой бульонной культуры или суспензии микробов, снятых с МПА, и распределяют ее равномерно по всей поверхности агара шпателем, изготовленным из пастеровской пипетки. После этого все пробирки ставят в термостат на 15 мин при
температуре 37°. Затем в четыре пробирки вносят по одной капле
неразведенного фага, отступив от края агара на 8 - 10 мм, и ставят
их в штатив для стекания капли. В две пробирки каплю фага не
46
вносят, их оставляют для контроля. Все шесть пробирок вновь ставят в термостат при температуре 37° на 6 - 8 ч.
В пробирках с фагом при положительных результатах возбудитель по ходу стекания капли не растет. След стекающей капли
будет обрамлен выросшей культурой; образуется как бы бордюр
вокруг дорожки.
Ценность этих методов заключается в том, что они могут быть
использованы не только для исследований патологического материала, но и для выявления возбудителя в воде, фураже, почве, смывах с предметов внешней среды.
При выборе методов выявления возбудителя хотелось обратить внимание на метод выявления лецитиназной активности.
В стерильном флаконе со стеклянными бусами смешивают одну часть куриного желтка и две части физиологического раствора
поваренной соли (0,85%). Такую стерильно приготовленную среду
разливают в пробирки по 5 мл, засевают изучаемой культурой и
помещают в термостат при температуре 37°. Вас. anthracis не свертывает желтка даже при инкубации 2-3 суток.
При определении выделенных культур большое значение имеет о б н а ружение капсул и капсулообразование. Наличие капсул
может быть определено прямым путем, при бактериоскопии мазков
или с применением одного из изложенных методов окраски капсул.
Рекомендуются также посевы на специальные питательные
среды -ГКИ, Томова, Буза и др. Такие исследования осуществляются редко, при необходимости детализированного изучения культуры..
Серологические исследования
Немаловажное значение в диагностике сибирской язвы имеет
peaкция преципитации по Асколи (рисунок 35). С ее помощью уда-
ется обнаружить сибиреязвенный антиген. Суть ее состоит в том,
что при соприкосновении преципитирующей сыворотки с материалом, содержащим сибиреязвенный антиген, в пробирке образуется
кольцо серо-желтого цвета.
47
Рисунок 35 – Реакция преципитации по Асколи
Принципиальная схема постановки реакции может быть пред-
ставлена в таком виде:
- преципитирующая сыворотка и экстракт из исследуемого ма-
териала;
- преципитирующая сыворотка со стандартным сибиреязвен-
ным антигеном (контроль с заведомо положительным результатом);
- преципитирующая сыворотка и экстракт из органов здорово-
го животного (контроль);
- нормальная сыворотка и экстракт из исследуемого материала
(контроль).
Чаще всего реакция преципитации ставится при исследовании
кожевенного сырья на предмет заражения его возбудителем сибирской язвы. Многолетняя практика применения реакции полностью
себя оправдала, и реакция Асколи является обязательным диагностическим методом при исследовании кожевенного и мехового сырья.
48
Современные подходы к индикации и идентификации воз-
будителя
Для решения проблемы индикации и идентификации исследователи конструируют питательные среды, обладающие высокими
селективными и дифференциально-диагностическими свойствами,
разрабатывают методы выявления специфических антигенов, нуклеотидных последовательностей и определения различий в биохимической активности. Как правило, повышение селективности сред
достигается за счет добавления к питательной основе химических
препаратов с избирательным антимикробным действием, хромогенных субстратов, позволяющих дифференцировать микроорганизмы по биохимической активности, биостимуляторов для ускоренного получения и частичной идентификации бактериальной
культуры, значительным смещением рН и т.п. Так, для выделения
возбудителя сибирской язвы предложен широкий арсенал селективных и дифференциально-диагностических питательных сред –
дифференциально-диагностическая среда для выделения и культивирования сибиреязвенного микроба (СВК), PLET-агар, среда для
диагностики сибирской язвы (АДЭСБ), среда с сорбитом и бромтимоловым синим, диагностическая среда для выделения возбудителя
сибирской язвы и близкородственных бацилл группы Bacillus
cereus, среда Донована и Bacillus cereus селективный агар Мозеля
(MYP-агар). Для обнаружения специфических сибиреязвенных антигенов в дополнение к реакции Асколи исследователями предлагается эритроцитарный иммуноглобулиновый диагностикум, иммуноглобулины диагностические сибиреязвенные вегетативные и
споровые адсорбированные флуоресцирующие (ФГУЗ СтавНИПЧИ), иммунохроматографический тест (ФГУП ГНЦ ПМБ, п. Оболенск), для выявления специфических нуклеотидных последовательностей - набор реагентов «АмплиСенс® B.anthracis-FRT»
(ФГУН ЦНИИЭ и ФГУЗ «РосНИПЧИ «Микроб»), а для биохимической идентификации представителей рода Bacillus тест-система
Microgen Bacillus ID. Поскольку лизабельность сибиреязвенными
бактериофагами в соответствии с МУК 4.2.2413-08 является одним
из трех опорных тестов, практике, в дополнение к фагу FahВНИИВВиМ (ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии, п. Вольгинский) предложен новый сибиреязвенный бактериофаг «R/D-RH-6»
(ФГУП ГНЦ ПМБ, п. Оболенск), который предлагается использовать в реакции определения чувствительности к фагу и в реакции
нарастания титра фага для выявления Bacillus anthracis в смешанных культурах, а также объектах внешней среды.
49
Новые тест-системы для идентификации представителей
рода Bacillus
- Хромогенная диагностическая среда, содержащая динатрие-
вую соль пара-нитрофенилфосфата (ДС-p-NPP);
- Агар Донована и MYP – (Мозеля) агар;
- Тест-система для биохимической идентификации представи-
телей рода Bacillus;
- Фаг тест-набор «R1 Оболенск»;
- Иха-тест B. anthracis;
Эритроцитарный иммуноглобулиновый диагностикум
Фосфатазы объединяют большую группу ферментов, представляющих собой один из подклассов гидролаз, катализирующих
реакции расщепления и синтеза органических соединений фосфора
с участием воды. В общем виде гидролиз фосфорорганических соединений может быть представлен следующим образом: R'R'' +
НОН ↔ R'H + R''OH. Различают специфические фосфатазы, действие которых направлено на какой-либо определенный субстрат, и
неспецифические, обладающие широкой субстратной специфичностью. Активность фосфатаз проявляется в широком диапазоне значений pH. По кислотности среды, в которой фермент проявляет
наибольшую активность, фосфатазы делят на щелочные (pH 8-10) и
кислые (pH 4-6). В практике микробиологических исследований
определением фосфатазной активности бактерий пользуются в целях идентификации и дифференциации родственных микроорганизмов, сходных по ряду других фенотипических признаков. Тест
основан на выявлении отщепившейся под действием фосфатазы
фосфатной группы от органического субстрата, содержащего фосфат. Образовавшиеся продукты фосфатазной реакции определяются по свойственной им природной окраске или по цвету добавленного соответствующего индикатора.
Техника постановки теста на щелочную фосфатазу. На мясопептонный агар с натриевой солью дифосфатфенолфталеина, pH
8,2 (±0,2), высевают отдельными штрихами суточные культуры сибиреязвенного микроба.
На одной чашке можно испытать 15-16 штаммов. Посевы инкубируют в термостате при 37 °С в течение 24-48 ч. При отсутствии
роста или слабом микробном росте время инкубации может быть
увеличено до 5 суток. Просмотр посевов ведется ежедневно. При
положительном результате реакции от молекулы натриевой соли
дифосфатфенолфталеина фосфатаза катализирует отщепление двух
молекул фосфогрупп — гидрофосфата натрия (Na,HP04) с образованием свободного фенолфталеина, имеющего светло-розовый
50
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]