Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Серологические реакции в диагностике инфекционных заболеваний. Учебное пособие
.pdf
11
иммунодефицитном состоянии, либо при активации фагоцитоза в ор-
ганизме.
Количество IgG увеличивается при вторичном иммунном отве-
те, аутоиммунных заболеваниях, вирусных, токсических и многих
других инфекционных заболеваниях, возбудители которых имеют
крупные размеры (протозойные инфекции, глистные инвазии и др.).
Уменьшение IgG наблюдается при иммунодефиците, чаще всего у де-
тей, бактерионосительстве, хронических инфекциях, аутоиммунных
заболеваниях и сывороточной болезни.
Увеличение Ig A говорит о местном характере инфекционного
процесса. Дефицит Ig A встречается, как правило, у людей с хрониче-
ским течением заболевания.
О выраженности аллергических реакций немедленного типа
(ГНТ) свидетельствует увеличение количества Ig Е в периферической
крови.
12
ИММУНОДИАГНОСТИКА ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
Иммунодиагностика — постановка диагноза инфекционного за-
болевания при помощи иммунологических (серологических) реакций,
которые широко применяются в различных областях медицины
и биологии. Велика их роль в диагностике бактериальных, вирусных
и других инфекций. Они служат изучению процессов гуморального
и клеточного иммунитета, иммунологии онтогенеза, злокачественных
новообразований, трансплантации органов и тканей, иммуногенети-
ки, а также используются для решения других вопросов, составляя
основу обширнейшей ныне науки — иммунологии.
В серологических реакциях участвуют два специфических ком-
плементарных по отношению друг к другу компонента: антиген (АГ)
и соответствующее ему антитело (АТ). Они составляют одну
специфическую систему типа «ключ+замок». Поэтому, зная один из
ингредиентов, например, АГ, можно определить гомологичное ему АТ
и наоборот.
Серологические реакции ставят в различных направлениях:
1 — сероидентификация — определение вида возбудителя при
помощи иммунных диагностических сывороток. При постановке ре-
акции в данном направлении от больного выделяется чистая культура
неизвестного возбудителя, которая используется в качестве АГ (ис-
следуемого материала). В лаборатории необходимо иметь иммунную
диагностическую сыворотку, которую получают гипериммунизацией
лабораторных животных (чаще всего кроликов) убитой микробной
клеткой известного вида. То есть иммунная диагностическая сыво-
ротка содержит в себе известные АТ, которые способны вступить
в специфическую связь со строго определенным АГ.
2 — серодиагностика — определение специфических АТ
в сыворотке больного при помощи диагностикума. При постановке
13
серологической реакции в направлении серодиагностики от больного
в качестве исследуемого материала берется сыворотка крови АТ. В ла-
боратории необходимо иметь диагностикум. Диагностикум — это
стандартная взвесь убитой микробной клетки известного вида (АГ). То
есть диагностикум содержит в себе известный АГ, который способен
вступить в специфическую связь со строго определенным АТ.
3 — сероиндикация — обнаружение возбудителя в исследуемом
материале от больного при помощи иммунных диагностических
сывороток. При постановке серологической реакции в направлении
сероиндикации от больного берется исследуемый материал, в составе
которого находится предполагаемый возбудитель (АГ). В лаборато-
рии необходимо иметь иммунную диагностическую сыворотку, со-
держащую специфические известные АТ, которые способны вступить
в специфическую связь со строго определенным АГ.
Любая серологическая реакция протекает в две фазы:
1 — специфическая фаза — соединение АГ бактерий с АТ, со-
держащимися в иммунной диагностической сыворотке (невидимая
фаза реакции);
2 — неспецифическая фаза — образование осадка, видимого невооруженным глазом.
Для диагностики инфекционных заболеваний чаще всего ис-
пользуются следующие реакции: реакция агглютинации (РА), реак-
ция пассивной или непрямой гемагглютинации (РПГА или РНГА),
реакция преципитации (РП), реакция нейтрализации токсина или ви-
руса (РН), реакция торможения гемагглютинации (РТГА), реакции
связывания комплемента (РСК).
14
РЕАКЦИЯ АГГЛЮТИНАЦИИ (РА)
Агглютинация — склеивание микробных клеток при взаимодействии их АГ с гомологичными АТ иммунной диагностической
сыворотки.
АГ, участвующий в РА и связанный с микробной клеткой, полу-
чил название агглютиногена, а АТ — агглютинина. Образующийся
специфический комплекс «корпускулярный АГ+АТ», выпадающий при
положительной реакции в виде осадка, именуется агглютинатом.
РА проявляется в том, что в равномерно мутной взвеси клеток,
например, бактерий, при добавлении иммунной диагностической сы-
воротки происходит окучивание бактериальных клеток, в результате
чего образуются иммунные комплексы, имеющие вид зернышек или
хлопьев, которые постепенно оседают на дно пробирки и жидкость
над осадком становится абсолютно прозрачной.
Каким же образом формируются иммунные комплексы в РА?
Микробная взвесь (раствор АГ) имеет равномерное мутное
окрашивание. Почему же микробы, например, бактерии, в обычном
состоянии не оклеиваются и не выпадают в осадок? Вокруг каждой
бактериальной клетки, помещенной в раствор электролита, формиру-
ется гидратная оболочка. Поскольку мембрана бактериальной клетки
несет отрицательный заряд, то диполи воды располагают вокруг
клетки согласно тому, как это показано на рис. 1. Таким образом,
каждая бактериальная клетка, окруженная гидратной оболочкой, ста-
новится носителем отрицательного заряда, что придает микробной
взвеси стабильность.
При добавлении такой микробной взвеси (АГ) к иммунной сы-
воротке, содержащей специфические АТ к данному АГ, происходит
следующее. Специфические АТ разрушают гидратную оболочку АГ
в месте нахождения ее детерминанты и присоединяются к нему.
15
В том месте, где присоединилось АТ, обнажается отрицательно заря-
женная мембрана клетки (АГ), куда устремляются катионы электро-
лита. То есть бактериальная клетка с присоединившимся к нему АТ
становится носителем положительного заряда. В результате две раз-
ноименно-заряженные клетки склеиваются. Количество склеившихся
микробных клеток в иммунном комплексе прямо пропорционально
валентности АТ иммунной сыворотки.
Рис. 1. Формирование иммунных комплексов
Таким образом, для проявления РА необходимы следующие
условия:
1. АГ должен иметь корпускулярную природу (целая микробная
клетка, эритроцит и т. д.).
2. Эквивалентное соотношение АГ и АТ.
3. Наличие электролита (физиологический раствор).
РА может быть поставлена двумя способами:
1. РА в пробирках (развернутая).
2. РА на стекле.
16
В соответствии с решаемыми задачами, РА применяется
в двух направлениях:
1 — сероидентификация возбудителя, выделенного от больного;
2 — серодиагностика инфекционного заболевания.
При постановке РА в направлении сероидентификации из орга-
низма больного выделяют чистую культуру неизвестного возбудителя
(АГ), которую вносят в физиологический раствор из расчета 3 млрд
микробных клеток на 1мл раствора. В лаборатории необходимо иметь
иммунную диагностическую агглютинирующую сыворотку (АТ).
Агглютинирующие сыворотки подразделяют на неадсорбиро-
ванные и адсорбированные.
Неадсорбированые сыворотки получают гипериммунизацией
кроликов (ослов) убитой микробной клеткой известного вида. Поми-
мо специфических АТ, эти сыворотки содержат еще и групповые АТ.
Для того, чтобы исключить в реакции агглютинацию АГ групповыми
АТ неадсорбированные сыворотки титруют. Количество агглютини-
рующих АТ в иммунной сыворотке оценивается по ее титру — максимальному разведению сыворотки, которое еще дает РА с данной
взвесью микробных клеток. РА с неадсорбированными сыворотками
ставится в пробирках (развернутая). Для этого агглютинирующую
сыворотку разводят физиологическим раствором и в каждое разведе-
ние сыворотки вносят по 2–3 капли взвеси чистой культуры, выде-
ленной от больного концентрацией 3 млрд микробных тел/мл. Разве-
денные сыворотки готовят следующим образом.
Допустим, титр агглютинирующей сыворотки равен 1:12 800.
Следовательно, необходимо приготовить следующие разведения сы-
воротки: 1:3 200, 1:6 400, 1:12 800, 1:25 600, 1:51 200, то есть разведе-
ние, равное титру сыворотки должно быть средним. Влево и вправо
от титра в ряду разведений сыворотки готовятся 2–3 разведения,
обычные кратные 2.
17
РА считается положительной в том случае, если она произойдет
в разведении, равному половине титра агглютинирующей сыворотки.
То есть в нашем примере при положительном результате реакции в разведении сыворотки равном 1:10 000 должно произойти просветление
мутного раствора АГ с выпадением осадка, который проявляется после
легкого встряхивания пробирок. Результат развернутой РА предварительно учитывается после 2 ч пребывания пробирок в термостате,
окончательно — на следующий день, после пребывания пробирок при
комнатной температуре.
Адсорбированные сыворотки. При постановке РА иногда наблюдается явление групповой агглютинации (о чем упоминалось выше),
когда агглютинирующая диагностическая сыворотка агглютинирует не
один вид микробов, а несколько видов, родственных один другому.
Например, агглютинирующая брюшнотифозная сыворотка может аг-
глютинировать не только брюшнотифозных бактерий, но также А- и Бпаратифозных. Это явление, затрудняющее точную серодиагностику
и идентификацию бактерий, может быть устранено, если применять
в РА адсорбированные агглютинирующие сыворотки. Их получают из
неадсорбированных сывороток методом истощения по Кастеллани.
Метод основан на том, что из иммунной сыворотки последова-
тельно извлекают групповые АТ, добавляя к ней групповые АГ. Агглютинат, образовавшийся в результате агглютинации, осаждается
и удаляется. В сыворотке остаются только специфические АТ, кото-
рые не вступили в реакцию с групповым АГ. Такая сыворотка при ее
использовании уже не дает групповой агглютинации. Эта сыворотка
называется адсорбированной, ее не титруют и реакцию с ней ставят
на стекле, которая наступает в течение нескольких минут.
Монорецепторные сыворотки — принцип получения их основан
на реакции Кастеллани. Специфические монорецепторные сыворотки
выпускается видовыми или типовыми и, соответственно, содержат
АТ только к определенному виду или типу бактерий.
18
При постановке РА в направлении серодиагностики от больного
в качестве исследуемого материала берется сыворотка крови, в которой
необходимо определить неизвестные специфические АТ. АГ в данном
случае является диагностикум — взвесь убитых бактерий известного
вида. РА с целью серодиагностики ставится в пробирках. Обычно гото-
вят следующие разведения сыворотки больного: 1:50, 1:100, 1:200, 1:400,
1:800. В каждое разведение сыворотки больного вносят по 3 капли
диагностикума. Предварительно реакцию учитывают после 2 ч пребывания пробирок в термостате, окончательно через 24 ч пребывания
пробирок при комнатной температуре. РА в направлении серодиагно-
стики считается положительной в том случае, если она произойдет
в диагностическом титре.
Диагностический титр — то разведение сыворотки больного,
при котором принято считать реакцию положительной для данного
инфекционного заболевания. Для большинства инфекционных забо-
леваний диагностическим титром является разведение сыворотки
больного равное 1:200.
Методика постановки РА
РА на стекле используется в направлении сероидентификации
возбудителя. В данном случае на одну половину предметного стекла
наносится крупная капля физиологического раствора (контроль на ис-
ключение спонтанной агглютинации), а на другую половину — такую
же каплю адсорбированной (монорецепторной) агглютинирующей сы-
воротки. Затем в каждую каплю вносится идентифицируемый возбуди-
тель в виде капли взвеси в физиологическом растворе или в виде непо-
средственно взятой бактериологической петлей агаровой культуры.
Приготовленные таким образом реакционные смеси помешива-
ют осторожным покачиванием предметного стекла до наступления
19
отчетливо видимой на глаз агглютинации в опытной капле. При по-
ложительном результате агглютинация в опытной капле наступает
в течение 5 мин на фоне отсутствия таковой в контроле.
РА в пробирках (развернутая) используется в двух направлениях:
1 — серодиагностики и 2 — сероидентификации. Для этих целей
берется серия пробирок, в которых готовятся разведения сыворотки
больного (при серодиагностике) или агглютинирующей диагностиче-
ской сыворотки (при сероидентификации). Разведения сыворотки
приготовить, согласно тому, как это представлено в табл. 1 и 2. Затем
в каждое разведение сыворотки внести по 3 капли диагностикума
(при серодиагностике) или взвеси чистой культуры, выделенной от
больного (при сероидентификации). Взвесь чистой культуры готовят
следующим образом: выделенную суточную агаровую культуру смы-
вают 1 мл физиологического раствора и готовят взвесь из расчета
3 млрд микробных тел/мл раствора.
К опыту ставится контроль для АГ: физиологический раствор +
+ раствор АГ.
Таблица 1
Постановка развернутой РА с целью серодиагностики
Ингредиенты, мл
Разведения
1:50
1:100
1:200
1:400
1:800
К
Сыворотка больного
2,0
1,0
1,0
1,0
1,0 (вылить 1,0)
–
Физиологический
раствор
–
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
Бруцеллезный
диагностикум
3к
3к
3к
3к
3к
3к
Результаты
Вывод:
20
Таблица 2
Постановка развернутой РА с целью сероидентификации
Ингредиенты, мл
Разведения
1:1 600
1:3 200
1:6 400
1:12 800
1:25 600
К
Неадсорбированная
агглютинирующая
коли-сыворотка
(титр 1:25 600)
2,0
1,0
1,0
1,0
1,0
(вылить
1,0)
–
Физиологический
раствор
–
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
Взвесь чистой
культуры, выделенной
от больного
3к
3к
3к
3к
3к
3к
Результаты
Вывод:
РЕАКЦИЯ ПРЕЦИПИТАЦИИ (РП)
Преципитацией называется явление осаждения АГ (преципити-
ногена) из раствора при воздействии на него иммунной диагностиче-
ской сывороткой, содержащей АТ (преципитины). Иммунная сыво-
ротка, преципитирующая определенный вид АГ, готовится путем па-
рантеральной гипериммунизации животного именно этим АГ.
Преципитирующие сыворотки титруют по АГ. Наибольшее разведение
АГ (преципитиногена), при котором получается ясно выраженная РП,
называется титром преципитирующей сыворотки.
Выпадение нерастворимого комплекса АГ+АТ в виде осадка
наблюдается при определенных условиях:
1 — эквивалентное соотношение ингредиентов (образовавшийся
комплекс может раствориться в избытке АГ или АТ);
2 — АГ должен иметь характер коллоидного раствора;
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]