Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Методические указания к лабораторным работам по физиологии растений.pdf
31
Процентное содержание общей воды вычисляют по формуле:
А=М –
,
где
А – относительное содержание общей воды в исследуемом
материале,
М – 100% (исходный вес навески в относительном выражении);
М1 – первоначальный вес сырой массы исследуемого материала;
М
2
- вес сухой массы исследуемого материала после
высушивания.
Работа 2. Определение содержания свободной воды
рефрактометрическим методом.
Ход работы. Для определения свободной воды на
аналитических весах отвешивается навеска измельченных растений
(0,5г). Переносится в бюкс, предварительно взвешенный на
аналитических весах, и взвешиваются еще раз.
После взвешивания в бюкс добавить пипеткой Мора 4 мл 30%
раствора сахарозы и в третий раз взвесить на аналитических весах.
После этого содержание тщательно взболтать и оставить на 1-1,5 ч.
По данным взвешивания подсчитать массу взятой растертой
пробы (Р) и массу исходного раствора сахарозы (В).
Пользуясь рефрактометром, определить концентрацию сахарозы
в исходном растворе, а через 1-1,5 ч. в растворе, взятом из бюкса,
после настаивания с растительным образцом.
Расчет содержания свободной воды (У) проводится
У = Р*
где
Р – масса сахарозы, взятая для настаивания исследуемого материала,
г;
В1 – процентное содержание сахарозы в исходном растворе;
В2 – процентное содержание сахарозы в растворе после настаивания
исследуемого материала.
Работа 3. Определение содержания связанной воды.
Ход работы. Определение содержания связанной воды в
исследуемом растительном материале проводится по разности между
количеством общей воды в абсолютном выражении для навески,
подвергавшейся настою с сахарозой, рассчитывается по
32
а = Р*
А
где
а – содержание общей воды в абсолютном выражении в навеске,
взятой для настаивания с сахарозой;
А – содержание общей воды, определяемое после высушивания
растительного материала в сушильном шкафу, % ;
m – масса навески, взятой для настаивания с сахарозой (0,5 г).
Зная содержание общей воды а и свободной У, по разности
находим количество связанной воды Х.
Х = а – у.
При расчете процентного отношения свободной и связанной
воды от общей используют формулу:
у%=
или Х%=
33
Лабораторное задание 7.
Углеродное питание растений. Пигменты листа
К пигментам листа относят: 1) хлорофиллы; 2) каротиноиды; 3)
фикобилины; 4) антоцианы. Наиболее важными из пигментов
являются зеленые хлорофиллы а и б (у высших растений).
Хлорофилл – это сложный эфир хлорофилловой кислоты и двух
спиртов метилового и фитола.
Хлорофилловая кислота – это Mg – производное порфирина,
соединения, состоящего из четырех колец пиррола, связанных друг с
другом метиновыми мостиками (_СН=) и добавочного
циклопентанового кольца.
Наличием конъюгированной по кругу системы двойных связей,
а также присутствием Mg объясняется характерная для хлорофилла
зеленая окраска.
Значительное число активных химических групп в молекуле
хлорофилла обусловливает высокую реакционную способность
зеленых пигментов.
Магний не меняет валентности, но молекула хлорофилла
принимает участие в реакциях окисления – восстановления за счет
миграции двойных связей и превращения азота пиррольных колец в
анион и катион.
Все растения, разлагающие воду в процессе фотосинтеза имеют
два хлорофилла, у высших растений – это хлорофиллы а и б.
Хлорофилл а отличается по строению от хлорофилла б тем, что
у него во втором пиррольном кольце находится метильная группа –
СН3, а у хлорофилла б – альдегидная –
Хлорофиллы обладают высоко выраженной способностью к
флуоресценции. Весьма интенсивна красная флуоресценция у
растворов хлорофиллов.
Хлорофилл поглощает свет избирательно. Главные максимумы
поглощения находятся в красной и синей частях спектра.
Наличие в молекуле хлорофилла высокомолекулярного спирта
фитола придает ему липоидные свойства, поэтому хлорофилл, как и
другие пигменты листа, извлекается органическими растворителями.
34
Каротиноиды включают каротины и ксантофиллы, которые
представляют собой ненасыщенные соединения и состоят из остатков
изопрена. Ксантофиллы в отличие от каротинов содержат кислород.
В растениях встречается в основном В-каротин – спутник
хлорофилла, который является провитамином А.
Каротиноиды участвуют в процессе фотосинтеза, передавая
энергию возбуждения на хлорофилл. Каротиноиды защищают
хлорофилл от разрушения.
Классическое определение фотосинтеза – это образование
зелеными растениями органических соединений из углекислого газа и
воды с помощью энергии света. В настоящее время следует говорить
о фототрофной функции высших растений, подчеркивая этим
сложность и многообразие процессов, которые осуществляются с
помощью энергии света, поглощенного пигментами. Фототрофная
функция – это совокупность процессов поглощения, превращения и
использования в различных эндергонических реакциях энергии
световых квантов. Фотосинтез – основной, но все же частный случай
потребления энергии света.
Значения фотосинтеза:
1. Образование органических соединений, постоянное
пополнение их убыли.
2. Накопление в продуктах фотосинтеза грандиозных
количеств химической энергии.
3. Выделение кислорода, сохранение уровня его в атмосфере,
необходимого для существования подавляющей части организмов
населяющих планету.
4. Устранение возможности накопления в атмосфере избытка
СО2. Уникальна неповторима роль фотосинтеза как процесса, в ходе
которого СО2 – конечный продукт распада органической материи –
вновь возвращается в круговорот веществ природы.
В процессе фотосинтеза происходит поглощение световой
энергии и ее превращение в энергию химическую. Механизм
фотосинтеза можно разделить (условно) на три этапа.
1. Фотофизический – поглощение света пигментами и
образование возбужденных молекул.
2. Первичные фотохимические реакции, в которых
принимают участие возбужденные молекул.
2.1. Процесс фотохимического разложения воды (фотолиз),
сопровождающийся выделением молекулярного кислорода.
35
2.2. Перенос водорода воды на НАДФ по ЭТЦ фотосинтеза.
2.3. Образование АТФ за счет световой энергии
(фотосинтетическое фосфорилирование).
3. Химические, темновые реакции, в которых принимают
участие продукты фотохимических реакций – восстановление СО2 до
углеводов водородом воды, перенесенным на НАДФ, и с участием
энергии АТФ. Первые два этапа происходят с участием света,
поэтому называются световыми реакциями фотосинтеза, для третьего
этапа свет не нужен – реакции называются темновыми.
Работа 1. Изучение оптических и химических свойств
пигментов листа.
Задание.
1. Получить спиртовую вытяжку пигментов листа.
2. Разделить смесь пигментов, содержащихся в спиртовой
вытяжке, на две части. Определить и зарисовать зону поглощения в
световом спектре выделенных пигментов. Сравнить зону поглощения
каждой из них с зоной поглощения хлорофилла.
3. Получить каротин в чистом виде. Определить и зарисовать
его спектр поглощения. Сравнить со спектром поглощения
хлорофиллов.
4. Установить факторы, определяющие окраску хлорофиллов.
Определить спектр поглощения феофитина и сравнить со спектром
поглощения хлорофиллов. Опыт зарисовать.
Оборудование и материалы. Весы, ступка с пестиком, ножницы,
спектроскоп, водяная баня, градуированная пипетка, воронка с
фильтрами, пробирки, пробка к пробирке, капельница с водой,
этиловый спирт, кристаллическая щелочь (NaOH), дымящаяся HCI в
капельнице.
1.1. Извлечь пигментов листа.
Ход работы. Сухие листья (0,5г) мелко нарезать ножницами и
тщательно растереть в фарфоровой ступке. Удалить жилки, затем
прилить 15 мл 96% этилового спирта, перемешать и дать
возможность настоять в течение 10 минут.
Полученную спиртовую вытяжку отфильтровать через сухой
фильтр в чистую сухую пробирку. Фильтрат содержит два зеленых
хлорофилла – а и б и два желтых пигмента – каротин и ксантофилл.
1.2. Разделение пигментов листа по методу Крауса. Метод
разделения пигментов по Краусу основан на их различной
36
растворимости в несмешивающихся растворителях, в спирте и
бензине.
Ход работы. В пробирку налить 2мл спиртовой вытяжки,
прилить к ней 3мл бензина и добавить 3-5 капель воды. Закрыть
пробирку и энергично взбалтывать в течение 3-5 минут и затем дать
отстояться до разведения жидкости на два слоя. Бензин, как более
легкий, подчиняется вверх, а спирт останется внизу.
Спиртовой слой будет окрашен в желтый цвет от присутствия в
нем ксантофилла, а верхний бензиновый слой останется зеленым от
хлорофиллов. Второй желтый пигмент (каротин) также перейдет в
бензиновый слой. Если разделение пигментов идет плохо, то нужно в
пробирку добавить 1-2 капли воды и хорошо взболтать. От избытка
же воды нижний спиртовой слой может помутнеть, тогда следует
прибавить немного спирта, вновь взболтать и дать отстояться.
С помощью спектроскопов определить зоны поглощения
выделенных пигментов. Для определения зоны поглощения света
хлорофиллами исходную спиртовую вытяжку необходимо разбавить
водой в десять раз
1.3. Выделение каротина путем омыления хлорофилла.
Ход работы. Хлорофилл является сложным эфиром, поэтому
его можно омылять щелочью. Для этого в пробирку с разделенными
по методу Крауса пигментами прибавляет кусочек NaOH и энергию
взбалтывают до растворения в щелочи. Хлорофиллы обмыливаются
(распадаются на натриевую соль дикарбоновой кислоты хлорофилла
и свободные спирты – метиловый CH3 OH и фитол C20H39OH и
переходят в нижний спиртовый слой). В верхнем бензиновом слое
остается каротин. Определить спектр поглощения каротина.
1.4. Получение феофитина и обратное замещение водорода
металлом.
Хлорофилл представляет собой металлоорганическое
соединение. В центре молекулы хлорофилла находится Mg, который
связан с азотом пиррольных колец. Под влиянием кислоты от
хлорофилла отщепляется Mg, на место которого становится водород
кислоты. В результате реакции образуется феофитин C37H32OH
4
(COOH) – (COOC20 H39) бурого цвета и соль MgCl2.
Ход работы. Для опыта берут в пробирку 2-3 мл спиртовой
вытяжки хлорофиллов и прибавляют капли крепкой соляной кислоты.
При взбалтывании зеленый цвет раствора меняется на бурый.
Полученный феофитин может быть вновь превращен в
37
металлоорганическое соединение с восстановлением зеленой
окраски.
Для этого в побуревший раствор бросают кристаллы
уксуснокислой меди и нагревают раствор на горячей водяной бане.
При этом бурый цвет меняется на ярко-зеленую окраску.
Работа 2. Определение фотосинтеза. Образование первичного
крахмала на свету (проба Сакса).
Задание. Установить влияние света на интенсивность
фотосинтеза по накоплению первичного крахмала в листьях
растений. Прибор и проявленные на листьях результаты опыта
зарисовать.
Оборудование и материалы. Обескрахмаленные растения,
стеклянные колпаки с подставками, черная бумага, скрепки, стакан,
два кристаллизатора на 50мл, вата, мел, 10%-ная HCI, освещение
рабочих мест различной интенсивности.
Ход работы. Для того, чтобы убедиться в образовании крахмала
на свету, необходимо удалить крахмал, уже имеющийся в листьях. С
этой целью растения предварительно выдерживают в темноте до
полного обескрахмаливания листьев. В нашем опыте срезают лист
растения и опускают черешком в стакан с водой (срез возобновляют
под водой).
Лист растения заключают в непрозрачный экран из черной
бумаги в экране с двух сторон вырезают какую-нибудь фигуру,
цифру или слово. После закрепления экрана прибор устанавливают
под колпак и выставляют на свет. Продолжительность экспозиции 2-3
часа.
С целью повышения содержания углекислоты и влажности под
колпак вносят чашечку с увлаженной ватой и кусочек мела, залитый
10%-ной HCI.
При окончании опыта листа освобождают от экрана и, свернув,
помещают в пробирку с водой, которую кипятят на спиртовке с
целью разрушения плазматических образований. Затем лист кладут в
спирт и выдерживают до обесцвечения, которое может быть ускорено
нагреванием на водяной бане. После этого, лист осторожно
расправив, помещают в чашку Петри и заливают раствором йода.
В местах освещения за счет цветной реакции с йодом
проявляется ассимиляционный крахмал. По интенсивности
окрашивания проявленного рисунка судят о влиянии освещения или
цветных экранов на ход фотосинтеза.
38
Лабораторное занятие 8.
Дыхание растений
Дыханием называется окислительный процесс распада
органических соединений в живых тканях всех организмов. Распад
этих соединений при дыхании происходит постепенно, с
образованием нестойких промежуточных веществ и выделением
энергии. Некоторое количество промежуточных продуктов растения
используют для синтеза более сложных органических веществ, для
осуществления которого требуется энергия. Кроме того, растению
необходима энергия для других жизненных процессов.
Неиспользованные для вторичного синтеза промежуточные
соединения распадаются до конечных продуктов - углекислого газа и
воды, которые выделяются в атмосферу. В окружающую атмосферу
выделяется также в виде тепла часть не использованной энергии.
У растений различают дыхание аэробное, или нормальное, при
котором на окисление органических соединений используется
кислород котором атмосферы и дыхание анаэробное или
безкислородное (брожение).
Под окислением понимают не только присоединение к
окисляемому веществу кислорода, но и отнятие от него водорода и
электронов. Названные типы окисления имеют место при процессе
дыхания.
Дыхательным материалом растениям служат разные
органические соединения из которых в первую очередь используются
углеводы. Первые стадии как аэробного, так анаэробного дыхания
являются общими сущность их состоит в активировании моносахаров
путем присоединения к ним под действием соответствующих
ферментов фосфорной кислоты. Активированные моносахара легко
распадаются на триозы с образованием пировиноградной кислоты.
Дальнейшее окисление пировиноградной кислоты в зависимости
от аэробных и анаэробных условий протекает по - разному. В
анаэробных условиях пировиноградная кислота в зависимости от
вида брожения превращается в этиловый спирт, молочную или
масляную кислоту. Конечными продуктами аэробного дыхания
являются углекислый газ и вода, с выделением при окислении одной
молекулы гексозы в 86 ккал энергии.
39
C6H12О6 + 6CО2 + 6H2О + 686 ккал.
Приведенное уравнение положено в основу наиболее
распространенных методов изучения дыхания и определения его
интенсивности. Сущность этих методов заключается в учете
изменения газового состава окружающей растение атмосферы. Эти
изменения можно наблюдать с учетом количества выделяемого при
дыхании углекислого газа, и поглощенного кислорода.
Работа 1. Определение интенсивности дыхания по количеству
выделенной углекислоты.
Задание. Определить интенсивность дыхания по CO2 различных
растительных образцов. Составить таблицу.
Материалы и оборудование. Растительный материал, 0,1N
раствор Ва(ОН)2, 0,1 N раствор НСl, бюретка, фенолфталеин (в
капельнице), весы, разновесы, одинаковые – конические колбы (2 шт)
и резиновые пробки к ним (одна пробка с металлическим крючком),
куски марли (10x10).
Принцип метода. Интенсивность дыхания определяется по
количеству выделяемой углекислоты и выражается в мг CO2,
выделено за 1 час в расчете на 1 г массы растения.
Для определения, интенсивности дыхания в замкнутый сосуд
помещают навеску исследуемого материала, и определенное
количество раствора щелочи. Выделяемая в процессе дыхания
углекислота реагирует со щелочью, в результате чего концентрация
раствора уменьшается:
Ba(OH)2+CO2=BaCO3+H2O
Через определенное время оставшуюся в сосуде щелочь
титруют:
Ba(ОH)2+2HCl= BaCl2 +2H2О.
Cравнивают полученную величину с результатом титрования
такого же количества исходного раствора щелочи. Последнее
необходимо для определения исходной концентрации щелочи и
одновременно для учета того небольшого количества СО2, которое
содержалось в сосуде до опыты, а также поглощенного щелочью во
время открывания сосуда. Разность между результатами титрования
содержимого контрольного и опытного сосудов прямо
пропорциональна количеству выделенного при дыхании СО2.
Продолжительность экспозиции зависит от размера навески и
интенсивности дыхания исследуемого объекта. При очень короткой,
экспозиции разность между результатами титрования контрольной и
40
опытной колбой будет недостоверной. Для анализа берут различные
растительные образцы.
Ход работы. Поместить навеску исследуемого материала (0,5г)
в марлевый мешочек и прикрепить его к пробке при помощи крючка,
вставленного в пробку.
Провести пробную сборку установки, проверив, свободно ли
проходит мешочек с материалом через горло колбы и, не опускается
ли он слишком низко. Внести в колбу две капли фенолфталеина и
налить 10 мл 0,1 раствора Ва(ОН)2. Быстро опустить в колбу
материал плотно (вращательным движением) закрыть колбу пробкой,
и записать время начала опыта.
В контрольную (пустую) колбу также налить 10 мл барита и 2
капли фенолфталеина и плотно закрыть пробкой. Время от времени
колбы следует осторожно покачивать, чтобы разрушить пленку.
BaCO2, препятствующую полноте поглощения СО2, не допуская
попадания ни одной капли раствора на мешочек с материалом.
Через 1-2ч вынуть материал, быстро закрыть колбу пробкой и
отметить время окончания опыта. Провести титрование оставшейся
щелочи и 0,1 соляной кислоты до исчезновения розового
окрашивания.
Контрольную колбу можно титровать через 20 мин после
наливания раствора барита за это время колбы необходимо
периодически взбалтывать). Результаты записать в таблицу 7
Таблица 7
Объе
м
Масса
пробы,
г
Налито
Ва/ОН/2
, мл
Продолжитель
ность опыта, ч
Пошло HCl,
мл
Интенсив
ность
дыхания,
мг/г.ч
контро
ль
опыт
1 2 3 4 5 6 7
Интенсивность дыхания вычисляется по формуле
X=
=
мгСО
г
где
а – количество мл HCl, расходуемое на титрование контрольной
колбы;
в - количество HCl, на титрование опытной колбы;