Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Методические указания к лабораторным работам по физиологии растений.pdf
21
Ход работы. Берут две навески по 2 г наклюнувшихся и
непроросших семян пшеницы. Какую партию семян растирают,
заливают 20 мл воды, настаивают 10 мин и фильтруют. Фильтраты
делят поровну на две части, одна из которых кипятится 2-3 минуты.
После кипячения растворы охлаждают и восстанавливают их
первоначальный объем. Затем в каждую из четырех пробирок
приливают по 1 мл пирогаллола и 2 мл перекиси водорода. По
полученной пурпурной окраске в каждой пробирке судят о
присутствии и активности фермента в зависимости от состояния
исходного растительного материала.
Работа 3. Определение активности каталазы газометрическим
методом
Задание. Определить активность каталазы у различных
растительных объектов по количеству выделяемого О2 во времени.
На основании полученных данных вычертить график, сделать
сравнительный вывод.
Материалы и оборудование. Растительный материал,
газометрический прибор для определения активности каталазы,
ступка, пипетка, часы, песок, мел, 10% раствор Н2О2.
Ход работы. Навеску растительного материала в 5 г тщательно
растереть в ступке с небольшим количеством мела (в сырой материал
добавляют еще и песок). Растертый материал переносят в приемную
камеру газометрического прибора. Ступку ополаскивают 10 мл Н2О,
которую также выливают в прибор. На дно приемной камеры
устанавливают небольшой стаканчик с 5 мл H2О2. Прибор собирают и
устанавливают в нулевое положение. Уровень воды в бюретке
должен находиться на верхней отметке, что достигается
вертикальным перемещением емкости.
Подготовив прибор, включают часы, одновременно вводя в
исследуемый материал Н2О2. В дальнейшем необходимо слегка
встряхнуть приемную камеру для равномерного перемещения мезги и
Н2О2.
С момента начала опыта ведут наблюдения за выделением О2,
отмечая его объем по уровню опустившегося мениска в бюретке.
По условиям данного опыта, наблюдение продолжают в течение
5 мин, а отсчет производится через каждую минуту. Если выделение
кислорода прекращается раньше, то опыт прерывают на
соответствующей минуте наблюдения.
22
По ходу эксперимента может оказаться, что О2 выделится
больше, чем вмещает объем бюретки. В таком случае, пользуясь
системой клапанов, следует выпускать кислород из бюретки,
сохраняя его в приемной камере и, восстановив нулевое положение
прибора, продолжать опыт. Результаты наблюдений заносят в
таблицу.
Таблица. 5
Активность каталазы в мл О2 по минутам наблюдения
Наименование культуры
Периоды наблюдений,
мин
Общее количество О2,
выделенное: за время
опыта
1 2 3 4 5
Примечание. Устройство газометрического прибора для
определения активности каталазы.
Основные части прибора: приемная камера, бюретка (на 25 или
50 мин), емкость для запаса воды (ею может служить воронка). Все
они соединены между собой резиновыми шлангами так, что бюретка
и емкость для воды представляют замкнутую систему сообщающихся
сосудов. Поэтому, перемещая их относительно друг друга в
вертикальном положении, можно изменить уровень воды в бюретке
(при установке нуля).
Приемная камера может быть двух типов или в виде у –образной
емкости с отверстием в верхней точке изгиба, или в виде
широкогорлой склянки на 100-150 мл. Емкости закрываются
пробками с вмонтированными в них стеклянными трубками. Пробки
с помощью резинового шланга через тройник соединены с бюреткой.
Бюретка и емкость для воды крепятся на штативе в
вертикальном положении. На резиновом шланге, соединяющем
приемную камеру с бюреткой, и на свободном резиновом конце,
отходящем от тройника, устанавливают клапаны-зажимы.
Работа 4. Определение активности пероксидазы.
Принцип метода. Метод основан на определении скорости
реакция окисления бензидина до образования синего продукта
окисления определенной концентрации, заранее устанавливаемой на
фотоэлектроколориметре (А. Н. Бояркин, 1961).
Ход анализа. Навеску растительного материала 50-200 мг тонко
растирают в ступке с ацетатным буфером pH = 4,7 и переносят в
23
мерную колбу емкостью 50 мл. После 10 мин настаивания вытяжку
фильтруют. Для измерения активности фермента необходимо брать
вытяжку такого разведения, чтобы изменение окраски происходило
за 20-50 сек. В две кварцевые кюветы (2 см) приливают по 2 мл
ферментной вытяжки, 2 мл бензидина, 2 мл воды.
Измерение производят на фотоэлектроколориметре ФЭК-56М
при красном светофильтре (8). Вначале устанавливают нулевую
точку, затем правым барабаном отводят стрелку гальванометра в
крайнее положение (E = 0,125 или 0,25).
В левую кювету наливают 2 мл воды, а в правую (опытную) 2 мл
перекиси водорода из пипетки с широким отверстием или из
короткой пробирки. С внесением первой капли включают
секундомер. Стрелка гальванометра начинает двигаться от края
шкалы к нулевому делению. Секундомер останавливают, когда
стрелка достигнет нулевого деления. По найденной скорости реакции
вычисляют активность фермента:
б
,
где
А - активность пероксидазы (отн.ед).
E - экстинция 0, 125 или 0, 25,
a - разведение вытяжки,
б - степень разведения в кювете (4),
p - навеска, г,
t - время,
с. - толщина слоя, (2 см).
Данные по активности пероксидазы представить в виде графика.
24
Лабораторное занятие 5.
Механизм поглощения, передвижения и выделения воды
растениями
Все физиологические процессы в растении нормально
протекают лишь при полном его обеспечении водой. Вода не только
растворитель, но и активный структурный компонент клетки. Она
участвует в биологических превращениях, например, обеспечивает
взаимодействие между молекулами, служит субстратом для
фотосинтеза, участвует в дыхании и в многочисленных
гидролитических и синтетических процессах.
Вода обладает высокой теплоемкостью, поэтому способствует
стабилизации температуры растения. Пронизывая все его органы, она
создает в нем непрерывную фазу, обеспечивая связь органов друг с
другом, а также возможность передвижения по растению
питательных веществ. Вода играет существенную роль в сохранении
формы травянистых растений, поддерживая их клетки в состоянии
тургора.
Водный баланс растения определяется соотношением между
поглощением и отдачей воды. Для сведения водного баланса без
дефицита необходимо, чтобы расходование влаги листьями
компенсировалось ее поглощением через корни.
Деятельность нижнего концевого двигателя, состоящая в
активном поглощении воды корневой системой, проявляется в плаче
и гуттации растений. Силу, принимающую воду вверх по сосудам,
называют корневым давлением. Работа верхнего концевого двигателя
обусловлена испарением воды с поверхности листа и называется
транспирацией. Присасывающее действие транспирации передается
корнем в форме гидродинамического натяжения, связывающего
работу обоих двигателей. Различают транспирацию устьичную и
кутикулярную. Обычно эти процессы идут одновременно со
значительным преобладанием первого у взрослых листьев
большинства растений.
Транспирация является важным физиологическим процессом,
так как способствует созданию непрерывно протекающего через
растение тока воды, который обеспечивает передвижение веществ по
растению. Транспирация – главный двигатель этого тока, в силу чего
25
создается известная автоматичность в возмещении потерянной
растением влаги.
Транспирация понижает температуру испаряющих воду листьев
и тем самым способствует нормальному ходу фотосинтеза и других
физиологических процессов.
Для учета транспирации можно использовать определенную
величину – интенсивность транспирации.
Интенсивность транспирации есть количество испарений воды в
граммах в 1 час с квадратного метра листовой поверхности.
Интенсивность транспирации обычно определяют весовым методом.
Работа 1. Определение интенсивности транспирации.
Задание. Определить интенсивность транспирации. Прибор
зарисовать. Сделать выводы о зависимости транспирации от внешних
условий и различных вариантов опыта.
Материалы и оборудование. Транспирационный прибор, лист,
часть или целое растение, весы, чашка Петри, лист бумаги, ножницы.
Ход работы. Лист растения помещают в трнспирационный
прибор (пробирку с водой). Смонтированный прибор с листом
взвешивают. Через 2 часа экспозиции взвешивание повторяют.
Разница в массе показывает количество испарившейся воды с
поверхности за данный промежуток времени. Площадь листа
растения определяют весовым методом, для чего листовую пластинку
растения помещают на лист писчей бумаги и тщательно карандашом
обрисовывают контур. Проекцию листа вырезают и взвешивают.
Затем вырезают из бумаги квадрат I0хI0см (100 см2) и тоже
взвешивают. Площадь листа растения определяют по формуле:
S =
М
м
,
где
М – масса проекции листа растения;
м – масса I см2 бумаги. H2O
Расчет интенсивности транспирации ведется по формуле:
ИТ =
=
г H2O на 1 м2 за час,
где
M1 – масса прибора с листом до опыта;
M2 – масса прибора с листом после опыта;
t – продолжительность опыта, час;
S – площадь листа растения, см2;
10000 – пересечет на м2;
26
Работа 2. Определение относительной транспирации.
Задание. Определить относительную транспирацию и сделать
сравнительные выводы об интенсивности испарения воды с открытой
водной поверхности и интенсивности транспирации. При этом
следует помнить, что суммарная площадь устьиц составляет лишь 23% от всей площади листа.
Материалы и оборудование. Чашка Петри с налитой в нее
водой, весы, линейка, данные по интенсивности транспирации.
Ход работы. В чашку Петри наливают воду, взвешивают с
точностью до второго знака и ставят в те же условия, в которых
определяют интенсивность транспирации. Через определенное время
(1-2ч) повторно взвешивают. Убыль в массе указывает количество
испарившейся воды.
Расчет интенсивности испарения производится по формуле:
Е =
,
где
M1 – масса чашки Петри с водой до опыта;
M2 – масса чашки Петри с водой после опыта;
t – продолжительность опыта, час;
S – площадь чашки Петри (ПR2 см2);
10000 – пересчет на м2.
Относительная транспирация рассчитывается по формуле.
ОТ =
ИТ
Е
Работа 3. Определение состояния устьиц методом
инфильтрации и кобальтовой пробы.
3.1. Метод инфильтрации.
Задание. Определить степень открытия устьиц в конкретных
условиях освещения у различных растений. Результаты наблюдений
занести в таблицу. Сделать выводы.
Материалы и оборудование. Растения, находящиеся в
различных условиях освещения. Шкала из веществ с различной
степенью поверхностного натяжения (ксилол, керосин, спирт).
Ход работы. На нижнюю поверхность листа растения в
различные места нанести по одной капле ксилола, керосина, спирта.
Нанесенные вещества (в зависимости от степени открытия устьиц)
проникнут в межклетники или испарятся, не оставив следа.
27
Проникновение в мезофил листа происходит по законам
капиллярного движения. Спирт проникает только через широко
открытые устьица, керосин – через средне открытые, а ксилол
способен просачиваться через микроскопические отверстия,
соответствующие узко открытым устьицам.
Поэтому при широко открытых устьицах, в лист проникнут все
три вещества, при средне открытых – керосин и узко открытых
устьицах – только ксилол.
О проникновении веществ в межклетники листа судят по
появлению просвечивающегося пятна, напоминающего масляный
развод на бумаге.
Таблица 6.
Степень открытия устьиц, определенная методом инфильтрации.
Наименование растений
Степень открытия устьиц
Широко
открытые
(спирт)
Средне
открытые
(керосин)
Узко
открытые
(ксилол)
Герань
+ + +
Роза
+ + -
Бегония
+ - -
Примечание. Таблица 6 заполнена для примера.
3.2. Кобальтовая проба (метод ШТАЛЯ).
Задание. Установить относительную скорость транспирации во
времени у различных растений или у одного растения, но с
различных поверхностей листа (верхняя и нижняя).
Материалы и оборудование. Растения в различных условиях
освещения, фильтровальная бумага, пропитанная CoCl
2,
два
покровных стекла, суровые нитки, электронагревательный прибор.
Ход работы. Принцип метода.
Метод основан на способности CoCl2, присоединяя 6Н2О,
изменять окраску от синего до розового цвета. На лист растения с
верхней и нижней сторон накладывают полоски бумаги, пропитанные
CoCl2 и просушенные до синего цвета. Бумага прикрывается
покровными стеклами, которые закрепляют суровыми нитками.
Смонтированный прибор в подвешенном состоянии крепится к
побегу. После монтажа прибора отмечают время начала опыта и
после этого ведут наблюдение за скоростью порозовения бумаги во
времени. По полученным результатам устанавливается относительная
28
скорость транспирации у различных объектов (листья из различных
ярусов; верхняя и нижняя стороны, различные культуры и т.д.).
4. Присасывающее действие листьев (демонстрационный опыт).
Задание. Установить наличие верхнего концевого двигателя,
дать объяснение механизма его действия, прибор зарисовать.
Материалы и оборудование. Ветки пихты, ели, сосны, замазка,
кипяченая вода, каучуковая пробка, чашки для воды, штатив высокий
чугунный с лапками и муфтами, нож, линейка, прибор для
засасывания ртути растением (стеклянная толстостенная трубка),
спиртовка, спички, чашечка для ртути, часы.
Ход работы. Прибор, состоящий из стеклянной толстостенной
трубки, заполняет поверху прокипяченной водой. В верхнюю часть
прибора вставляется ветка растения, плотно зажатая в каучуковую
пробку. Конец трубки спускают в чашечку с ртутью, на пробку слегка
нажимают так, чтобы выдавить часть воды. Засосать в трубку
небольшой столбик ртути. Для наблюдения удобнее, чтобы
первоначальный уровень ртути в трубке был выше уровня ртути в
чашке. Отмечают положение уровня ртути и следят по часам за
быстротой его подъема.
При постановке опыта необходимо учесть следующее: внутри
прибора не должно быть пузырьков воздуха; та часть ветки, которая
вводится в трубку, должна быть очищена от коры до камбия и не
иметь боковых веток.
5. Механизм присасывающего действия листьев
(демонстрационный опыт по засасыванию воды гипсовым блоком).
Задание. На основании наблюдений за присасыванием воды
гипсовым блоком дать объяснение пассивного механизма
поглощения и передвижения воды по растению. Прибор зарисовать.
Материалы и оборудование. Тонкая стеклянная трубка,
соединенная с небольшой воронкой, залитой гипсом, кипяченая вода,
чашечка с ртутью, штатив с зажимами.
Ход работы. Берут стеклянную воронку, залитую гипсом
(гипсовый блок) и плотно соединяют со стеклянной трубочкой,
наполненной водой, при помощи каучукового шланга. Трубочку
опускают в чашку с ртутью.
Вода, испаряясь с поверхности гипса, будет тянуть за собой (в
силу молекулярного сцепления) воду из трубки, а ртуть, засасываясь,
будет подниматься до гипсового блока.
29
6. Определение наличия корневого давления путем наблюдения
гуттации (демонстрационный опыт).
Задание. Путем наблюдения за выделением растениями воды в
капельно-жидком состоянии (гуттации) установить наличие
корневого давления и описать его механизм. Опыт зарисовать.
Материалы и оборудование. Молодые проростки (один
настоящий лист) зерновых культур, выращенных в кристаллизаторе;
стеклянный колокол, стеклянная палочка.
Ход работы. За 1-2 часа до начала занятий растения накрывают
стеклянным колоколом, перед занятием колокол снимают и
демонстрируют капли воды, образовавшиеся на кончиках листьев в
процессе гуттации. Осторожно стеклянной палочкой капли воды
стряхивают с листьев, растения вновь покрывают колоколом и ведут
наблюдения за появлением новых капель воды.
Для определения влияния внешних факторов на поглотительную
деятельность корней кристаллизатор можно охладить, установив его
на лед или долив в питательный субстрат осмотически деятельный,
но безвредный раствор (сахароза или КNО3 в концентрациях от 0,2 до
0,5M).
и демонстрации влияния влажности воздуха на транспирацию и
гуттацию необходимо иметь растения в двух кристаллизаторах. В
этом случае, после встряхивания капелек воды с листьев один из них
остается открытым.
30
Лабораторное занятие 6.
Определение связанной воды рефрактометрическим методом
Принцип метода. Вода в клетке бывает свободная и связанная
(условно). Связанной водой является вода, входящая в
гидратационные оболочки и прочно связанная с заряженными
молекулами, ионами и коллоидами.
Эти формы воды обладают различными физическими
свойствами и имеют различное физиологическое значение.
Свободная вода определяет активность физиологических процессов,
связанная – обуславливает агрегатную устойчивость гидрофильных
коллоидов, тем самым способствуя стойкости растительного
организма против неблагоприятных условий внешней среды.
Связанную воду нельзя извлечь из живой клетки, поэтому она
может быть определена по разности между общим содержанием воды
и количеством свободной воды. Общая вода определяется путем
высушивания растительного образца в сушильном шкафу при
t=105 °С . Свободная – осмотическим путем, погружением
растительного образца в раствор сахарозы.
Задание. Определить процентное содержание общей воды в
заданном растительном материале, количество свободной и
связанной воды в процентах от общей. Определение форм повести в
различных вариантах заложенного опыта – на разных фонах
удобрений, на разных сортах растений и т.д.
Материалы и оборудование. Растительный материал различных
вариантов опыта, два металлических и два стеклянных бюкса на
каждый вариант опыта, аналитические весы, термостат, пинцет,
ланцет или ножницы, стеклянные палочки, раствор сахарозы (30%).
Работа 1. Определение общей воды.
Ход работы. Для определения общего содержания воды в
растительном объекте необходимо мелко посеченный материал
поместить в предварительно взвешенный на аналитических весах
сухой бюкс и отвесить необходимое количество3-5грамм.
Отвешенный материал помещается в сушильный шкаф при
105°С. Высушивание образца ведется до получения постоянного веса
бюкса с навеской. Постоянный вес устанавливается контрольными
взвешиваниями, при которых должны совпасть не менее, чем два
последних взвешивания, произведенные с интервалом в 30 минут.