Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Методические указания к лабораторным работам по физиологии растений.pdf
11
Задание. Определить ИЭТ для клеток различных тканей
первичного корешка подсолнечника или гороха. Результаты
наблюдений зарисовать.
Материалы и оборудование. Проросшие семена подсолнечника
или гороха, лезвие безопасной бритвы, восемь пробирок, четыре
часовых стекла, кисточка, препаровальная игла, микроскоп,
предметные стекла, 0,1M лимонная кислота, 0,2M Na2HPO4, 0,1%
раствор эозина, 0,01% раствор метиленовой синей, две пипетки на 10
мл, две бюретки на 25 мл, стандартный лист миллиметровой бумаги.
Ход работы. 1. Приготовить в пробирках 8шт. буферных
растворов в соответствии с табл.3.
Таблица 3
Изготовление буферных растворов
рН раствора
Соотношение реактивов, мл
0,2М Na2HPO4
0,1М лимонная кислота
2,2
0,20
9,80
3,0
2,05
7,95
3,6
3,22
6,78
5,0
5,15
4,85
5,4
5,57
4,43
6,0
6,31
3,69
7,0
8,23
1,77
8,0
9,72
0,28
2. Окрашивание срезов. Для этого на четыре часовых стекла
наливают раздельно 5 мл 70% этилового спирта, 3 мл 0,1% раствора
эозина, 3 мл 0,01% раствора метиленовой синей, 5мл
дистиллированной воды.
По мере приготовления тонкие поперечные срезы в количестве
24 шт. вначале помещают для фиксации в спирт на 5 мин. Из спирта с
помощью кисточки срезы переносят в эозин, затем в метиленовую
синюю. В каждом из красителей препарат выдерживают по 10 мин.
После окрашивания срезы промывают 2-3 мин в дистиллированной
воде. Отмытые препараты помещают по 3 шт. в каждую из пробирок
с буферным раствором на 1,5-2 ч.
3. Определение ИЭТ растительной тканей. После экспозиции в
буферных растворах срезы переносят на предметное стекло и
размещают в три ряда последовательно в соответствии с увеличением
12
рН. При микроскопировании выбирается один из трех препаратов для
каждого значения рН с наиболее заметной окраской.
В растворах со значением рН ниже ИЭТ белков исследуемой
ткани метиленовая синяя десорбируется в раствор, а ткань,
удерживающая розовый краситель-эозин, будет окрашена в розовый
цвет. Наоборот, в буферных растворах с pH выше ИЭТ ткани,
белками будет удерживаться метиленовая синяя, и ткань окрасится в
синий цвет.
При величине рН буферного раствора, равной ИЭТ, кислый и
основной красители адсорбируются в равных количествах и ткань
приобретает сиреневую или фиолетовую окраску.
Таблица 4
Определение ИЭТ
Наименование
культуры и ткани
Цвет ткани при pH
Величина
2,2
3,0
3,6
5,4
6,0
7,0
8,0
ИЭТ
Подсолнечник
Горох
Примечание. Если в опыте не удается обнаружить буферного
раствора по промежуточной окраске, то ИЭТ можно вычислить как
среднюю величину, лежащую между резким переходом между
цветами - розовым и синим.
13
Лабораторное занятие 3.
Общие свойства ферментов на примере амилазы
В растениях реакция протекает легко и с большой скоростью,
потому что в любой живой клетке находятся многочисленные
биологические катализаторы, называемые ФЕРМЕНТАМИ или
энзимами, которые способны в тысячи и даже миллионы раз ускорять
течение химических реакций.
ФЕРМЕНТЫ – специфические катализаторы белковой природы,
ускоряющие течение определенных химических реакций и играющие
важнейшую роль в обмене веществ.
Механизм действия ферментов заключается в снижении энергии
активации, необходимой для прохождения химической реакции.
Энергия активации – это избыточное количество энергии,
необходимое для прохождения реакции между молекулами при
столкновении.
При ферментативном катализе реагирующее вещество/субстрат/
соединяется с ферментом, в результате молекула субстрата
становится более активной/возрастает её энергетический уровень/
вследствие поляризации, смещения электронов, деформации связей.
Поэтому энергия активизации комплекса субстрат-фермент будет
меньше, чем энергия активации чистого субстрата.
После окончания реакции комплекс субстрат-фермент
распадается, фермент освобождается и может соединиться с новым
молекулами субстрата.
Все ферменты по строению делятся на две большие группы:
однокомпонентные, состоящие только из белка, и двухкомпонентные,
в состав которых наряду с белком входит небелковая часть,
называющаяся простетической, или активной группой. Если активная
группа, легко отделяется от белковой части молекулы фермента, ее
называют коферментом.
В состав активных групп ферментов часто входят витамины и
металлы. Важнейшее биологическое свойство ферментов специфичность их действия, т.е. каждый фермент катализирует
определенную реакцию, действует на определенный субстрат.
Различают химическую, абсолютную специфичность, когда каждый
фермент действует на определенное химическое вещество, и
групповую специфичность, заключающуюся в том, что фермент
катализирует расщепление определенных химических связей в
14
близких по строению веществах. Бывает стереохимическая
специфичность, когда фермент действует на определенные
стереоизомеры органических соединений.
Ферменты обладают обратимостью действия, т.е. катализируют
реакцию в прямом и обратном направлении.
Активность ферментов может значительно изменяться в
зависимости от условий среды: температуры, кислотности среды и
др.
При повышении температуры скорость ферментативной
реакции, как и всякой химической, возрастает, но до определенного
предела. Температурный оптимум большинства растительных
ферментов - 40-60°С, при более высоких температурах их активность
резко снижается, при 70-80 С вследствие денатурации белка
ферменты необратимо разрушаются.
Наивысшая активность большинства растительных ферментов
отмечается при слабокислой или нейтральной реакции, которая
характерна для растительных клеток. Влияние на активность
ферментов связано с изменением состояния ионизации фермента,
субстрата или комплекса фермента и субстрата.
Вещества, которые усиливают каталитическую активность
ферментов, называются активаторами. Роль активаторов ферментов
часто выполняют ионы металлов: K+, Ca
2+,
Mg2+, Zn2+, Fe2+, Cu2+, Mn2+,
Со2+ и др., а также ионы: I-, Br-, Cl-.
Вещества, подавляющие действие ферментов, получили
название ингибиторов ферментов. Они могут быть общие и
специфические. К общим ингибиторам относятся соли тяжелых
металлов – свинца, серебра, ртути, вольфрама, трихлоруксусная
кислота, которые денатурируют белки.
Специфические ингибиторы действуют или по принципу
конкурентного ингибирования, когда ингибитор близок по своей
конфигурации к субстрату данного фермента, или блокируют часть
активного центра фермента. Так, азиды, цианиды, и окись углерода
блокируют металл в молекулах ферментов.
Наиболее наглядно познакомиться с общими свойствами
ферментов можно на примере каталитического действия амилаз.
Амилазы относят к классу гидролаз (3), подклассу гидролаз
гликозидов (карбогидраз). Наиболее распространены следующие
формы этих ферментов: и и амилазы и амилопектин – 1,6
глюкозидаза или R-фермент. Все они характеризуются
15
гидролитическим действием на крахмал, в результате расщепления
которого образуется дисахарид-мальтоза.
Крахмал состоит из смеси двух полисахаридов: амилозы,
представляющей собой неразветвленную цепь остатков - глюкозы,
соединенных 1,4-связями, и амилопектина разветвленной молекулы, в
которой наряду с 1,4 - имеются и 1,6-связи, находящиеся в местах
разветвления.
Фермент - амилаза катализирует гидролитическое
расщепление 1,4 - связей в молекуле, причем связи разрываются без
определенного порядка. Под действием - амилазы образуется
мальтоза, а также некоторое количество глюкозы сравнительно
низкомолекулярные полисахариды - декстрины.
Под действием фермента - амилазы также происходит
гидролиз 1, 4 - связей в молекуле, но в отличие от действия -
амилазы - амилаза последовательно отщепляет от концов молекулы
крахмала остатки мальтозы.
Амилопектин – 1, 6 - глюкозидаза, или R-фермент, катализирует
гидролитическое расщепление 1,6- связей в молекуле амилопектина,
т. е. действует на точки ветвления молекулы.
Таким образом, с участием перечисленных выше ферментов
молекулы крахмала полностью распадаются до мальтозы.
Промежуточные продукты расщепления крахмала амилазами -
декстрины – дает характерное окрашивание с иодом и по степени
уменьшения их сложности располагаются в следующем порядке:
амилодекстрины – дают с йодом фиолетовое окрашивание,
эритродекстрины – дают с йодом красное окрашивание,
ахродекстрины – не дают окрашивания,
мальтодекстрины – не дают окрашивания.
Работа 1. Получение вытяжки фермента (амилазы).
Задание. Получить вытяжку (фильтрат) амилазы.
Материалы и оборудование. Ячменный солод, ступка, водный
раствор глицерина, мерный цилиндр, пробирка, воронка, фильтраты,
капельница.
Ход работы. 3 г ячменного солода тщательно растереть в
ступке. Муку залить 20 мл водного раствора 50% глицерина,
перемешать, настоять 10 мин и затем профильтровать.
Фильтрат слить в капельницу. Полученная вытяжка содержит
смесь амилаз, поэтому дальнейшем условно именуется амилазой.
16
Работа 2. Влияние температуры на действие ферментов
(амилазы).
Задание. Установить влияние температуры на действие
ферментов. Опыт зарисовать.
Начертить график зависимости каталитических свойств
фермента от температуры. Сделать выводы.
Материалы и оборудование. Вытяжка фермента (амилазы) в
капельнице, 0,5% раствор крахмала, раствор иода (I2+KI),
дистиллированная вода, пробирки, спиртовка, три термостата с
температурой 30, 45,60 С.
Ход работы. В пять пробирок налить по 10 мл 0,5% раствора
крахмала, температуру которого довести соответственно до 20
(комнатная); 30, 45, 60 и 100 С (до закипания на спиртовке). Затем в
каждую из пробирок ввести по 10 капель амилазы и растворы вернуть
в исходные температурные условия на 8-10 мин. После экспозиции из
каждого раствора взять пробу в 1,0 мл и перенести в пробирки с
индикаторами (9 мл Н2О + 5 капель I2). В результате взаимодействия
йода с продуктами гидролиза в каждой из пробирок произойдет
цветная реакция.
Примечание. Для сравнительной оценки глубины гидролиза
необходимо приготовить эталон, характеризующий окрашивание
крахмала йодом по рецепту: 1,0 мл 0,5% раствора крахмала + 9 мл
Н2О + 5 капель I2.
Работа 3. Влияние концентрации фермента на его
каталитические свойства (гидролиз).
Задание. Установить влияние концентрации фермента на
скорость реакций. Опыт зарисовать. Вычертить график влияния
зависимости концентраций фермента на скорость реакции. Сделать
выводы.
Материалы и оборудование. Вытяжка амилазы в капельнице,
0,5% раствора крахмала, раствор йода (КI + I2), дистиллированная
вода, пробирки, штатив, термостат на 60°C.
Ход работы. В четыре пробирки налить по 10 мл 0,5% раствора
крахмала. Температуру растворов в пробирках довести до 60°C.
Затем в каждую пробирку ввести соответственно по 4, 8, 16 и 32
капли амилазы. Пробирки встряхнуть и вновь поставить в термостат.
Через 5-10 мин экспозиции из каждого раствора взять пробу в 1 мл и
перенести в пробирку с водным раствором иода (9 мл Н2О + 5 капель
I2). По полученной цветной шкале можно судить о результатах опыта.
17
Работа 4. Влияние pH среды на активность фермента (амилазы).
Задание. Определить величину рН внешнего раствора,
оптимальную для каталитического действия ферментов (амилазы).
Опыт зарисовать. Результаты опыта выразить графически. Сделать
выводы.
Материалы и оборудование. Буферные растворы с рН: 3,5,6,7, 8,
0,5% раствор крахмала, амилаза в капельнице, раствор иода (KI+I2),
пробирки, штатив, термостат на 60°C.
Ход работы. В пять пробирок налить по 8 мл буферного
раствора соответственно со значением pH: 3,5,6,8 и 8, затем прилить
по 2 мл 0,5% крахмала. Смеси прогреть в термостате до 60°С и в
каждую пробирку ввести по 5 капель амилазы. Растворы тщательно
перемешать и вновь установить в термостат на 5 мин. После
экспозиции каждую пробирку ввести по 5 капель йода.
18
Лабораторное занятие 4.
Ферменты класса оксидоредуктаз
К этому классу относят многочисленные ферменты,
катализирующие окислительно восстановительные процессы в
растениях. Эти ферменты имеют большое значение в процессе
дыхания растений. Под окислением понимают все химические
реакции, связанные с отдачей электронов от окислительного
субстрата, т. е. с увеличением положительных валентностей
вещества, а под восстановлением - присоединение электронов к
молекулам вещества, т. е. уменьшение положительных валентностей.
Реакция окисления веществ в организмах всегда сопровождается
реакциями восстановления.
Окисление веществ может идти путем присоединения кислорода
или отщепления водорода. Установлено, что большинство
биологических окислений осуществляется дегидрированием –
отщеплением водорода. Отщепление водорода от окисляемых
субстратов катализируется ферментами, которые получили название
дегидрогеназ.
По характеру своего действия они делятся на группу
анаэробных и аэробных дегидрогеназ.
Анаэробные дегидрогеназы – не способные присоединять
отнятый от субстрата водород непосредственно кислороду воздуха.
Такие дегидрогеназы передают водород соответствующим
ферментам, следующим за ними в цепи дыхания. Анаэробные
дегидрогеназы являются двухкомпонентными ферментами,
состоящими из белковой части и активной простетической группы.
К анаэробным дегидрогеназам относят пиридиновые
дегидрогеназы, коферментом которых является НАД
(никотинамидадениндинуклеотид) или НАДФ
(никотинамидадениндинуклеотидфосфат) (производные витамина
РР).
К анаэробным дегидрогеназам относится также и часть
дегидрогеназ флавиновой природы. Флавиновые анаэробные
ферменты не окисляют непосредственно субстрат дыхания, они
отнимают водород от восстановленных пиридиннуклеотидов и
передают его на цитохромы, глутатион и некоторые другие вещества,
восстанавливая их. Простетическая группа флавиновых ферментов
может быть, как в форме флавинмононуклеотида (ФМН), так и в
19
форме флавинадениндинуклеотида (ФАД) (производные витамина
В2- рибофлавина).
Большинство дегидрогеназ флавопротеинового типа могут
отдавать водород непосредственно кислороду воздуха. Такие
ферменты составляют группу аэробных дегидрогеназ. В отличие от
анаэробных флавиновых дегидрогеназ они в своем составе не
содержат металл, не ингибируются ингибиторами
металлосодержащих ферментов (азидами, цианидами, СО) и поэтому
называются ферментами остаточного дыхания. Помимо группы
дегидрогеназ в растениях присутствуют многочисленные оксидазы,
т.е. ферменты, способные передавать водород или электрон только
кислороду воздуха. Поскольку эти ферменты заканчивают собой цепь
передачи водорода и электрона, они иначе называются ферментами
завершающих этапов окисления, или терминальными оксидазами.
Сюда относятся: системы цитохромов и цитохромоксидазы,
полифенолоксидазы и аскорбиноксидазы. Цитохромы представляют
собой двухкомпонентные ферментные системы, состоящие из белка и
простетической группы, близкой по природе к гемоглобину. Основу
строения цитохромов составляет порфириновое ядро. В центре
порфиринового ядра цитохромов находится Fe. Изменение
валентности железа от двух до трех и определяет собой основные
свойства цитохромов. Полифенолоксидаза – это фермент,
окисляющий фенолы и их производные в хиноны в присутствии
молекулярного кислорода. В основе действия полифенолоксидазы
лежит обратимое превращение одновалентного атома Cu в
двухвалентное. Аскорбиноксидаза – это фермент, окисляющий
аскорбиновую кислоту в присутствии молекулярного кислорода в
дегидроаскорбиновую кислоту.
Помимо перечисленных истинных оксидаз, использующих для
окисления молекулярный кислород, в растении существует еще одна
система терминального окисления – пероксидазная система.
Пероксидаза относится к числу ферментов, широко
распространенных в тканях высших растений. Она играет большую
роль в процессе дыхания растений. Пероксидаза представляет собой
двухкомпонентный фермент, активной частью которого является
железо – порфирин. Окисление субстратов (полифенолы, гликозиды,
дубильные вещества, ароматические амины и др.) пероксидаза
осуществляет с помощью перекиси водорода или каких-либо
20
органических перекисей. Поэтому пероксидаза сопряжена с
деятельностью флавопротеиновых ферментов.
Каталаза разлагает перекись водорода на воду и молекулярный
кислород.
2Н2О2 - 2Н2О + О2
Каталаза имеет такую же простетическую группу, как и
пероксидаза - железопорфирин. Роль этого фермента заключается в
том, что он разлагает на воду и кислород ядовитую для клеток
перекись водорода, которая образуется в процессах дыхания и
фотосинтезе.
Работа 1. Обнаружение анаэробных дегидрогеназ.
Задание. Установить присутствие анаэробных дегидрогеназ в
растительном материале. Опыт зарисовать, сделать вывод.
Материалы и оборудование. Набухшие семена гороха, две
пробирки с пробками, метиленовая синяя, термостат на 60С, штатив.
Ход работы. С набухших семян гороха снимают кожуру и по 15
шт. помещают в две пробирки. Семена в одной из пробирок кипятят
10 мин. После кипячения семена в обеих пробирках заливают
метиленовой синей. Через 10 мин, краситель сливают, семена
ополаскивают и пробирки полностью заливают водой, закрывают
пробками и устанавливают в термостат на 2-2,5 час. После
экспозиции семена просматривают, результаты опыта обрабатывают.
Принцип метода обнаружения дегидрогеназ основан на способности
метиленовой синей восстанавливать водород дегидрогеназ.
Работа 2. Обнаружение активности пероксидазы.
В отличие от других аэробных дегидрогеназ акцептором
водорода для пероксидазы служит кислород перекисных соединений.
Используя кислород перекиси, пероксидаза катализирует окисление
различных фенолов и ароматических аминов. Например, при
действии пероксидазы на пирогаллол образуется пурпурогалин:
4C6H3(OH)3 + 9H2O2 → C20H16O9 + 4CO2 + 13H2O
Задание. Установить различные в степени активности
пероксидазы у проросших и непроросших семян пшеницы. Опыт
зарисовать, сделать выводы.
Материалы и оборудование. Семена проросшей и непроросшей
пшеницы, 2 ступки, две пробирки, две воронки, фильтровальная
бумага, спиртовка, пипетки, пирагаллол,10% раствор перекиси
водорода.